張 敏，孔冬妮，李 建，于義娟，黃 濤，王碧群，石寶蘭，朱 薇，鄭良益，李婷婷，謝紅玲*

(1.國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司，武漢430075；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

豬δ 冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是一種引起豬腹瀉的重要傳染病原，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，是當(dāng)前豬病防控的重大難題。PDCoV于2012年首次被報(bào)道，由Woo 等通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查在動(dòng)物糞便中成功檢測(cè)到[1]。目前在我國(guó)豬病料中也檢出PDCoV，由該病流行趨勢(shì)推測(cè)近年在我國(guó)爆發(fā)的可能性是存在的[2]。PDCoV感染后豬出現(xiàn)厭食、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水等臨床癥狀，與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)及豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)等感染十分類(lèi)似，給臨床診斷帶來(lái)極大困難，因此急需研究開(kāi)發(fā)高效、準(zhǔn)確、快速的抗原診斷方法[3-4]。膠體金免疫層析技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、可現(xiàn)場(chǎng)操作等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。本研究旨在研制PDCoV的免疫膠體金試紙條，實(shí)現(xiàn)臨床PDCoV的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，為豬腹瀉病防控奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

PDCoV為單股正鏈RNA病毒，含9個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，基因共編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為棘突蛋白S (spike)、囊膜蛋白E (envelope)、膜蛋白M (membrane)和核衣殼蛋白N (nucleocapsid)[5]。其中N蛋白是一種磷酸化的多功能結(jié)構(gòu)蛋白，保守性強(qiáng)，在感染早期的病豬血清中可檢測(cè)到高水平的N蛋白抗體[6-7]，因此可將N蛋白作為PDCoV感染早期血清學(xué)診斷的靶標(biāo)蛋白。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建表達(dá)和純化了有生物活性的PDCoV N蛋白，以其作為免疫原免疫小鼠，制備其單克隆抗體(Monoclonal antibodyies, McAbs)，同時(shí)應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，成功建立PDCoV免疫膠體金試紙條快速檢測(cè)方法，助力PDCoV的臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.2 PDCoV N蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)純化

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中登錄的PDCoV1601株病毒序列設(shè)計(jì)RT-PCR 引物，預(yù)期擴(kuò)增片段為1029 bp。引物序列為：PDCoV-NF：5'-TTTTCTCGAGATGGCCGCACCAGTAGTCCCTA￣CTACTG-3' (XhoI)；PDCoV-NR：5'-AAAA￣AAGCTTCTACGCTGCTGATTCCTGCTTTATCT￣CAA-3' (Hind III)。

1.2.2 PDCoV中N基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 參照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA并以其為模板，按上述引物擴(kuò)增PDCoV的N基因。RT-PCR 的反應(yīng)參數(shù)是：94 ℃預(yù)熱3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火溫度30 s，72 ℃延伸2 min(從第二步94 ℃變性到第四步72 ℃延伸進(jìn)行35個(gè)循環(huán))，72 ℃延伸10 min?；厥占兓腜CR 產(chǎn)物經(jīng)XhoI 和Hind III 酶切后克隆至pCold 1 載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCold 1-N。

1.2.3 重組PDCoV N蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 將pCold 1-N轉(zhuǎn)化至受體菌DH5a，待OD600nm達(dá)到0.4～0.5時(shí)，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，將BL21誘導(dǎo)前的培養(yǎng)物、離心上清、超聲破碎后的菌體和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。表達(dá)的上清再過(guò)Ni柱進(jìn)行純化，分別收集流穿液和各洗脫峰。并將各樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。同時(shí)將純化前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，加入合適稀釋倍數(shù)的陽(yáng)性豬血清作一抗，用羊抗豬IgG-HRP為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.3 單克隆抗體的研制

1.3.1 動(dòng)物免疫 將一定量的PDCoV N蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合并完全乳化后，小鼠腹股溝兩側(cè)靠近淋巴結(jié)區(qū)和頸部皮下多點(diǎn)免疫，每只50μg/0.5mL;21 d后2免，免疫劑量為首次免疫的一半，佐劑用弗氏不完全佐劑;間隔21 d后3免，免疫劑量和佐劑同2免;10 d之后采用腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量同首免，3 d后融合。

This room is twice as large as that one. 這個(gè)房間是那個(gè)房間的兩倍大。

1.3.2 細(xì)胞融合 按照常規(guī)方法無(wú)菌采取小鼠的脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞按10∶1比例混合，用PEG1450進(jìn)行融合，將融合之后的細(xì)胞加入鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞株篩選 利用間接ELISA法和間接免疫熒光法對(duì)所培養(yǎng)的雜交瘤上清進(jìn)行檢測(cè)，有限稀釋法對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行至少三次以上的克隆直至陽(yáng)性率為100%為止。

1.4 單克隆抗體的鑒定

1.4.1 腹水的生產(chǎn)及其純化 選擇12周齡以上的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射單克隆雜交瘤細(xì)胞，7 d之后收取小鼠腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水。

1.4.2 單克隆抗體的亞類(lèi)測(cè)定 按照洛陽(yáng)賽爾維公司單抗亞類(lèi)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行單克隆抗體亞類(lèi)的測(cè)定。

1.4.3 單克隆抗體特異性鑒定 將PDCoV、TGEV、PEDV分別接種長(zhǎng)滿(mǎn)單層的PK1細(xì)胞、Vero細(xì)胞、ST細(xì)胞的96孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后用冷丙酮固定；以PDCoV N蛋白單克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗鼠IgG作為二抗進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，于熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 免疫膠體金試紙條的制備及檢測(cè)

1.5.1 豬δ冠狀病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備用檸檬酸三鈉還原法制備25 nm 的金顆粒溶液，標(biāo)記量為30 μg/mL膠體金溶液的單克隆抗體E8，攪拌30 min，再加入終濃度20%的PEG 20000穩(wěn)定未結(jié)合的膠體金顆粒，8700 r/min離心30 min，棄上清，再用金標(biāo)緩沖溶液定容至2 mL。標(biāo)記好的膠體金溶液均勻涂布于金標(biāo)墊上，37 ℃烘干2 h備用。再將羊抗小鼠IgG二抗和單克隆抗體A10分別以1 mg/mL濃度包被硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線和檢測(cè)線，37 ℃烘干2 h備用。將準(zhǔn)備好的硝酸纖維素膜、樣品墊、金標(biāo)墊和吸水紙按順序粘貼到背襯板上，切條機(jī)切割成4 mm條，組裝成檢測(cè)試紙條。

1.5.2 豬δ冠狀病毒膠體金快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)

1.5.2.1 試紙條敏感性檢測(cè) 將105TCID50/mL的PDCoV病毒液用0.01 mol/L的PBS進(jìn)行1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000系列稀釋?zhuān)訕恿繛?.1 mL/孔，分別用本試紙條進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)判試紙條檢測(cè)敏感性。

1.5.2.2 試紙條特異性檢測(cè) 取PEDV、TGEV、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、PDCoV陰性對(duì)照樣品，分別用本試紙條進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)判試紙條特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDCoV重組N蛋白表達(dá)及鑒定

2.1.1 PDCoV N基因的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增出PDCoV N蛋白基因片段，電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，目的基因PDCoV N蛋白基因片段長(zhǎng)度為1029 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

1-12：PDCoV N gene；M：Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker圖1 PDCoV N基因PCR擴(kuò)增圖Fig 1 The PCR results of PDCoV N gene

2.1.2 PDCoV N蛋白表達(dá)、純化及鑒定 SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2、圖3)顯示，表達(dá)純化后的N蛋白分子量大小約為41 kD，與預(yù)期重組N蛋白分子量一致。同時(shí)重懸的菌體碎片和上清的條帶顏色深度相似，判定表達(dá)的N蛋白為分泌型表達(dá)。Western Blotting結(jié)果進(jìn)一步表明，重組質(zhì)粒樣品孔出現(xiàn)一條與目的蛋白大小相同的條帶，表明該重組N蛋白具有反應(yīng)原性(圖4)。

1：誘導(dǎo)表達(dá)前菌體；2：誘導(dǎo)表達(dá)前上清；3：誘導(dǎo)表達(dá)后破碎菌體重懸；4：誘導(dǎo)表達(dá)后上清；M：PageRuler 非預(yù)染蛋白Marker1：Bacteria protein before induction；2：Supernatant before induction；3：Supernatant of the bacteria lysate after induction；4：Supernatant after induction；M：PageRuler unstained protein ladder圖2 PDCoV N蛋白表達(dá)各成分鑒定圖Fig 2 Identification of PDCoV N protein

1：PDCoV N蛋白純化前；2：流穿雜蛋白樣；3-6：各洗脫時(shí)間段收獲PDCoV N蛋白樣；M：PageRuler 非預(yù)染蛋白Marker1：Unpurified PDCoV N protein；2：Impure protein；3-6：Purified PDCoV N protein；M：PageRuler unstained protein ladder圖3 PDCoV N蛋白過(guò)柱純化鑒定圖Fig 3 Identification and purification of PDCoV N protein

1：純化前樣；2：純化后樣；M：PageRuler 預(yù)染蛋白Marker1：Unpurified PDCoV N protein；2：Purified PDCoV N protein；M：PageRuler prestained protein ladder圖4 PDCoV N蛋白純化Western Blot鑒定圖Fig 4 Western Blot identification of purified PDCoV N protein

2.2 單克隆抗體研制及鑒定 共篩選2株分泌PDCoV N蛋白抗體單克隆雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為E8和A10。

2.2.1 單克隆抗體亞類(lèi)測(cè)定 E8亞類(lèi)是IgG2a，A10亞類(lèi)是IgG1。

2.2.2 腹水的純化 將純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖5，單克隆抗體重鏈大小為50 kD左右，輕鏈大小為25 kD左右。

1：E8單抗；2：A10單抗；M：PageRuler 非預(yù)染蛋白Marker1：Monoclonal antibody E8；2：Monoclonal antibody A10；M：PageRuler unstained protein ladder圖5 PDCoV N蛋白單抗純化SDS-PAGE鑒定圖Fig 5 SDS-PAGE identification of purified McAbs against PDCoV N protein

2.2.3 單克隆抗體特異性鑒定 E8、A10單克隆抗體均能與感染PDCoV的PK1細(xì)胞反應(yīng)，可見(jiàn)明顯綠色熒光，與陰性細(xì)胞無(wú)熒光。且單克隆抗體與感染TGEV、PEDV的細(xì)胞均不發(fā)生特異性反應(yīng)，無(wú)熒光信號(hào)，說(shuō)明E8、A10單克隆抗體只與PDCoV發(fā)生反應(yīng)，與TGEV、PEDV均不發(fā)生反應(yīng)，單克隆抗體特異性良好(圖6、圖7)。

A：感染PDCoV細(xì)胞孔；B：感染TGEV細(xì)胞孔；C：感染PEDV細(xì)胞孔；D：正常細(xì)胞對(duì)照A：Infected PDCoV；B：Infected TGEV；C：Infected PEDV；D：Negative control圖6 單克隆抗體E8特異性間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果(40×)Fig 6 Immunofluorescence assay(IFA) analyze the binding of antibody E8 and antigen(40×)

A：感染PDCoV細(xì)胞孔；B：感染TGEV細(xì)胞孔；C：感染PEDV細(xì)胞孔；D：正常細(xì)胞對(duì)照A：Infected PDCoV；B：Infected TGEV；C：Infected PEDV；D：Negative control圖7 單克隆抗體A10特異性間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果(40×)Fig 7 Immunofluorescence assay(IFA) analyze the binding of antibody A10 and antigen(40×)

2.3 免疫膠體金試紙條檢測(cè)方法的敏感性及特異性

2.3.1 試紙條檢測(cè)敏感性 105TCID50/mL的PDCoV病毒液分別進(jìn)行1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000稀釋?zhuān)渲?∶10、1∶100、1∶1000稀釋度檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，1∶10000稀釋檢測(cè)結(jié)果為陰性，本試紙條檢測(cè)PDCoV的最低限為100 TCID50，試紙條敏感性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。

1：1∶10稀釋?zhuān)?：1∶100稀釋?zhuān)?：1∶1000稀釋?zhuān)?：1∶10000稀釋1：the dilution of 1∶10；2：the dilution of 1∶100；3：the dilution of 1∶1000；4：the dilution of 1∶10000圖8 試紙條敏感性檢測(cè)結(jié)果Fig 8 Sensitivity test of dipstick

2.3.2 試紙條檢測(cè)特異性 分別用本試紙條對(duì)豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、PDCoV陰性對(duì)照樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，表明該試紙條不與豬其他病毒反應(yīng)，特異性好，試紙條特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。

1：豬流行性腹瀉病毒；2：豬傳染性胃腸炎病毒；3：豬瘟病毒；4：豬圓環(huán)病毒；5：陰性對(duì)照1：PEDV；2：TGEV；3：Swine fever virus；4：Porcine circovirus virus；5：Negative control圖9 試紙條特異性檢測(cè)結(jié)果Fig 9 Specificity test of dipstick

3 討 論

本研究成功構(gòu)建了PDCoV N蛋白表達(dá)載體，獲得了純化的PDCoV N蛋白，以PDCoV N蛋白作為免疫抗原，通過(guò)常規(guī)的免疫方法制備單克隆抗體，雖然耗時(shí)長(zhǎng)，但能在一定程度上增強(qiáng)免疫效果，制備出穩(wěn)定性及特異性?xún)?yōu)良的單克隆抗體[8]。PDCoV N蛋白氨基酸組成保守性高，達(dá)到97.1%～100%[9-11]，本實(shí)驗(yàn)制備針對(duì)PDCoV N蛋白的抗體對(duì)于病毒的早期診斷是切實(shí)有效的。本研究成功篩選到單克隆雜交瘤細(xì)胞株E8和A10，細(xì)胞連續(xù)傳代，長(zhǎng)勢(shì)良好，抗體分泌能力穩(wěn)定。間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)單抗鑒別PDCoV、PEDV、TGEV 病毒感染細(xì)胞的特異性良好，為我們進(jìn)一步的構(gòu)建免疫膠體金檢測(cè)方法提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[12-14]。

本研究制備的PDCoV膠體金檢測(cè)試紙條敏感性及特異性良好，檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠、有效，后續(xù)需用于臨床糞便樣品的檢測(cè)評(píng)估，收集更為全面的臨床數(shù)據(jù)，進(jìn)一步完善膠體金試紙條檢測(cè)方法。PDCoV臨床癥狀復(fù)雜多變，免疫膠體金試紙條檢測(cè)方法的建立從根本上解決檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣等問(wèn)題，具備快速確診、低成本、高敏感性等多種優(yōu)勢(shì)[10-11，15]。本試驗(yàn)成功建立了PDCoV免疫膠體金試紙條檢測(cè)方法，為臨床豬血清PDCoV快速檢測(cè)以及流行病學(xué)調(diào)查提供方便快捷檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。