馮月男，孫思邈，孔祥定,2，肖洪彬，王寬宇,2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

乳腺癌是目前世界上最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率為女性腫瘤的第一名并呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)，它的發(fā)生受遺傳、環(huán)境等多種因素影響。近年來(lái)，乳腺癌的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA(miRNA)通過(guò)調(diào)控機(jī)體內(nèi)的抑癌基因作為“腫瘤抑制因子”發(fā)揮作用，也可以通過(guò)調(diào)控機(jī)體內(nèi)的促癌基因作為“腫瘤激活因子”而發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而在不同類型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[1-2]。

巨噬細(xì)胞是一類在全身血液系統(tǒng)及組織中廣泛存在的免疫細(xì)胞，能夠分泌多種活性因子來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及免疫效應(yīng)作用。同時(shí)，巨噬細(xì)胞又是腫瘤微環(huán)境(TAMs)中重要的且數(shù)量最多的炎癥細(xì)胞，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤組織后，不同條件下可分化為抗腫瘤的M1型和促腫瘤M2型[3]。各種研究表明，腫瘤微環(huán)境中TAMs主要向M2型巨噬細(xì)胞極化，并促使腫瘤向惡性腫瘤進(jìn)展[4]。因此，逆轉(zhuǎn)TAMs表型由促腫瘤M2表型向抗腫瘤M1表型分化；減弱TAMs對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用在乳腺癌中的做進(jìn)一步探索具有一定價(jià)值。扶正消巖湯是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)外科主任王寬宇教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，研究表明該方治療乳腺癌有效，且前期實(shí)驗(yàn)證明了扶正消巖湯能提高乳腺癌荷瘤小鼠的免疫功能、調(diào)控炎癥因子表達(dá)，并且能夠抑制小鼠體內(nèi)瘤體增長(zhǎng)、有效減緩小鼠體質(zhì)量下降[5-6]。本研究從扶正消巖湯對(duì)腫瘤微環(huán)境中M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志因子出發(fā)，探討其對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)控作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

乳腺癌4T1細(xì)胞株和人單核細(xì)胞系THP-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，大鼠購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK(黑)2016-004，動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用符合國(guó)際動(dòng)物倫理法。

1.3 藥物

扶正消巖湯組成：黨參20 g，半枝蓮20 g，白術(shù)15 g，當(dāng)歸15 g，陳皮15 g，枸杞子15 g，山萸肉15 g，女貞子15 g，半夏10 g，莪術(shù)5 g，白芍10 g，茯苓10 g，上述中藥飲片購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)要求；環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H32020857，生產(chǎn)批號(hào)：18050825)。

1.4 主要儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(SHEL LAB，型號(hào)：SCO6WE)；潔凈工作臺(tái)(蘇凈安泰，型號(hào)：SW-CJ-1FD)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，型號(hào)：Ⅸ51)；酶標(biāo)儀(Diatek，型號(hào)：DR-200Bs)；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TGL-16c)；冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器，型號(hào)：H-2050R)；制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司，型號(hào)：IMS-20)；水浴鍋(金壇市江南儀器廠，型號(hào)：HH-W-600)。

1.5 試劑及耗材

胎牛血清(Gibco，批號(hào)：A3160802)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Procell，批號(hào)：PM150110)；胰酶-EDTA(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：GNM25200 )PBS溶液 (ASPEN，批號(hào)：AS1044 )；Mouse CD86分子(CD86)試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20930 )；Mouse CD163分子(CD163)試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20991)；Mouse白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20013)；Mouse 白細(xì)胞介素 10(IL-10)試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20005)；Mouse白細(xì)胞介素12(IL-12 p70)試劑盒(上海朗頓生物 ，批號(hào)：BPE20750)；Mouse 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20450)；Mouse Caspase3試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20250)；Mouse Caspase9試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20234)；Mouse Bcl2試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20227)；Mouse NF-κB試劑盒(上海朗頓生物，批號(hào)：BPE20817)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 乳腺癌4T1細(xì)胞和單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞置于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基、37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁情況，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 M2巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)

THP-1細(xì)胞置于含20 ng/mL的IL-4和20 ng/mL的IL-13的培養(yǎng)液中在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h，即為極化型M2巨噬細(xì)胞。

2.3 M2型乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

將2.2中獲得的M2型THP-1細(xì)胞上清液與4T1細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 含藥血清制備

24只大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、扶正消巖湯高、中、低劑量灌胃組，每組6只，生理鹽水組按照1 mL/100 g灌胃給藥、給藥組按照高、中、低分別為20、10、5 g/kg生藥按照1 mL/100 g灌胃給藥。每日灌胃給藥2次，連續(xù)7 d，于末次給藥1.5 h后，戊巴比妥麻醉，于腹主動(dòng)脈采血，置于含有枸櫞酸鈉的離心管中，以3 000 r/min離心15 min，取血漿，于56 ℃水浴條件下滅活30 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜除菌后，于-80 ℃下保存，備用。

2.5 扶正消巖湯給藥濃度及作用時(shí)間的篩選

M2型乳腺癌4T1細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后細(xì)胞貼壁，給藥組給予帶有含藥血清的培養(yǎng)液，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后棄培養(yǎng)液，按試劑盒說(shuō)明加CCK8試劑，置孵箱內(nèi)過(guò)夜，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度值，扶正消巖湯高劑量作用細(xì)胞48 h抑制細(xì)胞增殖效果最佳，故選擇此條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期M2型乳腺癌4T1細(xì)胞依據(jù)不同轉(zhuǎn)染操作和不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃榭瞻捉M、NC組(陰性對(duì)照組，只加入轉(zhuǎn)染試劑)、扶正消巖湯組及miR-146a mimic、miR-146a mimic+中藥組。miR-146a組轉(zhuǎn)染miR-146a mimic模擬物，NC組轉(zhuǎn)染miR-NC，空白組不做干預(yù)，轉(zhuǎn)染成功即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.7 CCK8法檢測(cè)miR-146a轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的影響

測(cè)miR-146a對(duì)4T1細(xì)胞增殖活性的影響。取“2.4”項(xiàng)下轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸液適量100 μL/孔傳至96孔板，24 h后細(xì)胞貼壁，換培養(yǎng)液，除空白組及中藥組外均加入miR-146a mimic，終濃度20 nmol/L，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按照CCK8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)吸光度值。

2.8 ELISA法檢測(cè)扶正消巖湯對(duì)轉(zhuǎn)染miR-146a4T1細(xì)胞上清液中M1、M2特異蛋白IL10、IL12、CD86、CD163的影響

采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.4”項(xiàng)下轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸液適量，按照相應(yīng)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作后，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的含量。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 ELISA法檢測(cè)扶正消巖湯對(duì)轉(zhuǎn)染miR-146a 4T1細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1的影響

方法同2.8。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 扶正消巖湯+miR146a過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞48 h細(xì)胞增殖的影響

由表1可知，與空白組比較，NC組對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞48h細(xì)胞增殖無(wú)影響(P>0.05)，扶正消巖湯組、miR-146a mimic組、miR-146α mimic+扶正消巖湯組對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞48 h細(xì)胞增殖有顯著抑制作用(P<0.01)。

表1 扶正消巖湯+miR146a過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞48h細(xì)胞增殖的影響

3.2 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞中IL10、IL12、CD86、CD163的含量

由表2可知，與空白組比較，NC組對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞上清液中IL10、IL12、CD86、CD163含量無(wú)明顯影響(P>0.05)，扶正消巖湯組、miR-146a mimic組、miR-146a mimic+扶正消巖湯組能顯著降低IL10、CD163含量(P<0.01)，顯著升高IL12、CD86含量(P<0.01)。

表2 扶正消巖湯+miR146a過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞中IL10、IL12、CD86、CD163含量的影響

3.3 ELISA法測(cè)細(xì)胞上清液中Caspase3、Caspase9含量

由表3可知，與空白組比較，NC組中乳腺癌4T1細(xì)胞上清液中Caspase3、Caspase9含量無(wú)明顯影響(P>0.05)，miR-146a mimic組、扶正消巖湯組、miR-146a mimic+扶正消巖湯組能顯著升高Caspase3、Caspase9含量(P<0.05，P<0.01)。

表3 扶正消巖湯+miR146a過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞中Caspase3、Caspase9含量的影響

3.4 ELISA法測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量

由表4、表5可知，與空白組比較，NC組對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量無(wú)明顯影響(P>0.05)，扶正消巖湯組、miR-146a mimic組、miR-146a mimic+扶正消巖湯組能顯著降低TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量(P<0.05，P<0.01)。

表4 扶正消巖湯+miR146a過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞中TNF-α、IL-1β含量的影響

表5 扶正消巖湯+miR146a過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞中RAF-6、IRAK-1、NF-κB含量的影響

4 討論

扶正消巖湯由12味中藥組成，其中黨參和半枝蓮為君藥，黨參能補(bǔ)中益氣、健脾益肺，半枝蓮能清熱解毒、散瘀消腫，二者配伍起到扶正祛邪的雙重功效；臣藥白芍配白術(shù)能夠提升正氣、益氣健脾，當(dāng)歸活血化瘀、補(bǔ)血行氣，增強(qiáng)君藥扶正祛邪的功效；再臣以莪術(shù)、半夏和陳皮用于消積、行氣、止痛，女貞子、山茱萸、 枸杞滋陰補(bǔ)腎，以上6味藥共同增強(qiáng)君藥扶正的功效；茯苓作為佐藥具有利水消腫的作用，同時(shí)能夠增強(qiáng)白術(shù)益氣健脾的功效，起到提高免疫功效，諸藥共奏扶正消巖之功[6]。

核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，它可以調(diào)控包括IL-1β、IL-6、IL- 12、TNF-α、黏附分子等在內(nèi)的許多分子，在各階段炎癥反應(yīng)及在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[7-8]。同時(shí)，NF-κB信號(hào)通路可以通過(guò)蛋白質(zhì)的生成來(lái)調(diào)控microRNA(miRNA)的水平，參與機(jī)體各種生理、病理過(guò)程。miR-146a是一個(gè)典型的多功能miRNA[9-11]，miR 146a在炎癥因子的刺激下有著高反應(yīng)性，有研究報(bào)道，在TNF-α、IL-1β的刺激下，機(jī)體可通過(guò)NF-κB通路上調(diào)miR-146a的表達(dá)，而白介素1受體相關(guān)激酶(IRAK-1)和腫瘤壞死因子相關(guān)手提因子(RAF-6)是miR-146a的直接靶分子，miR-146a通過(guò)與IRAK-1和RAF-6二者的特定區(qū)域結(jié)合轉(zhuǎn)錄后抑制二者的表達(dá)，負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB的激活，及下游細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β等的表達(dá)[12]。miR-146a過(guò)表達(dá)后，IRAK-1和RAF-6的表達(dá)水平降低，是的NF-κB通路受到抑制，從而降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)。本研究顯示，用miR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染后，上調(diào)miR-146a-5p的表達(dá)，在降低了IRAK-1和RAF-6蛋白表達(dá)的同時(shí)抑制了NF-κB的激活。與先前[9]的研究一致：miR-146a可通過(guò)抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB通路來(lái)下調(diào)乳腺癌中IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生。

巨噬細(xì)胞M1型和M2間的平衡是維持機(jī)體平衡和調(diào)控炎癥反應(yīng)所必需的[13]。研究發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)IL-12、CD86、低表達(dá)IL-10、參與炎癥反應(yīng)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)展，M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)IL-10、CD163、低表達(dá)IL-12，促進(jìn)免疫耐受[14-16]，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。在腫瘤微環(huán)境中，TAMs主要向M2型巨噬細(xì)胞極化促使腫瘤向惡性腫瘤進(jìn)展。TAMs在乳腺癌中的作用還需要進(jìn)一步探索，其可能成為乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染法上調(diào)乳腺癌4T1細(xì)胞中miR146a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR146a過(guò)表達(dá)+扶正消巖湯組可顯著升高IL12、CD86含量、降低IL10、CD163含量的同時(shí)促進(jìn)促凋亡蛋白Caspase3、Caspase9的表達(dá)、下調(diào)TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1的表達(dá)，說(shuō)明扶正消巖湯逆轉(zhuǎn)腫瘤由M2期向M1期的轉(zhuǎn)變從而抑制乳腺癌惡化進(jìn)展的作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)miR146a表達(dá)從而抑制NF-κB通路中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1因子的作用，激活促凋亡因子Caspase3、Caspase9的表達(dá)來(lái)調(diào)控乳腺癌的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)的完成為接下來(lái)課題組深入研究扶正消巖湯抗乳腺癌的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)支持。