張琦君，殷書敏，車勇，祝利民，羅振東，郭玉剛，徐振曄*

(1.上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院/上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第一康復(fù)醫(yī)院，上海 200434；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

原發(fā)性支氣管肺癌是當(dāng)前全球最常見的惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤病死率第1位。我國肺癌發(fā)病率近幾十年來呈現(xiàn)激增的趨勢，五年患病率已達(dá)130.2(1/10萬)，其中男性患病率居惡性腫瘤第2位；女性患病率居惡性腫瘤第4位[1]。目前肺癌的治療除了手術(shù)、放化療、靶向治療外，隨著抗PD-1/PD-L1等免疫療法藥物的出現(xiàn)，讓人們看到了肺癌治療的新突破，同時(shí)也認(rèn)識到在腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展的過程中，腫瘤浸潤性髓樣細(xì)胞(Tumor-infiltrating myeloid cells, TIMs)發(fā)揮了重要的作用，這些細(xì)胞一旦被招募到腫瘤微環(huán)境中，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向惡性發(fā)展，發(fā)生免疫逃逸，最終促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，還可以導(dǎo)致抗腫瘤治療失敗或耐藥發(fā)生，成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤浸潤性髓樣細(xì)胞表現(xiàn)為髓系起源，分化不成熟的特點(diǎn)，包括髓源性抑制細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)等一類粒系或單核系來源的細(xì)胞群，大量存在于實(shí)體瘤基質(zhì)中，在受到腫瘤、炎癥等刺激后，在腫瘤細(xì)胞、各種細(xì)胞因子、趨化因子等作用下，通過內(nèi)源性基因驅(qū)動或外源性途徑激動，被招募至腫瘤組織，分化成具有免疫抑制活性的一類髓樣細(xì)胞，對T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生潛在的免疫抑制作用，表現(xiàn)出明顯的免疫抑制活性，使得腫瘤細(xì)胞獲得干擾宿主免疫功能的作用，導(dǎo)致了腫瘤免疫逃逸的出現(xiàn)，刺激腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[2-3]。無論在動物實(shí)驗(yàn)還是臨床研究中均證實(shí)MDSCs、TAMs的數(shù)量與腫瘤的惡性程度及患者的不良預(yù)后相關(guān)，通過對MDSCs、TAMs的阻斷可在一定程度上恢復(fù)機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)，抑制腫瘤的生長[4]。

腫瘤免疫治療，與手術(shù)切除腫瘤、放化療或靶向藥物殺傷腫瘤細(xì)胞不同，通過人體自身的免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)干預(yù)腫瘤微環(huán)境的方式以消滅癌細(xì)胞。中醫(yī)藥整體觀念的思路與腫瘤免疫治療的理念不謀而合，通過對機(jī)體免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)及重塑，逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫逃逸的狀態(tài)，改善腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細(xì)胞及其功能，從而發(fā)揮抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的作用。徐振曄教授根據(jù)長期臨床觀察，基于現(xiàn)代肺癌患者發(fā)病特點(diǎn)，結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論中“金水相生”的概念，發(fā)揮張景岳補(bǔ)腎學(xué)術(shù)思想，在國內(nèi)首次提出肺癌治療的“精氣理論”，根據(jù)“益氣養(yǎng)精，解毒散結(jié)”的治療大法，研制中藥復(fù)方肺巖寧方，臨床研究提示使肺癌患者生存期、臨床癥狀方面獲益明顯[5],體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)肺巖寧方顆粒劑具有調(diào)節(jié)TAMs極化及其分泌的細(xì)胞因子，抑制Lewis肺癌細(xì)胞遷移的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察肺巖寧方對肺癌局部腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤性髓樣細(xì)胞MDSCs、TAMs的調(diào)控作用，挖掘其抑瘤作用的免疫基礎(chǔ)，深入探索其內(nèi)在機(jī)制，為其今后臨床開發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動物

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。SPF級C57BL/6純系小鼠38只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心代購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號:SYXK(滬)-2014-008。小鼠在動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫(25±2)℃，采用食飼料飼養(yǎng)方式，自由進(jìn)食與飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會審查，符合實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理相關(guān)規(guī)范，倫理編號：PZSHUTCM190628010。

1.2 藥品及試劑

肺巖寧方組方：生黃芪30 g，白術(shù)9 g，石見穿30 g，山慈菇12 g，蜂房9 g，干蟾皮6 g，仙靈脾15 g，黃精30 g，山茱萸15 g，靈芝15 g，七葉一枝花9 g，14貼中藥共計(jì)生藥2 520 g，于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化水煎提，水煎液經(jīng)醇提后將藥物濃縮至生藥含量為2 g/mL、4 g/mL[7]，-80 ℃保存?zhèn)溆?。IL-4 ELISA試劑盒(Cat:SD0168，Lot:20190315)、IL-10 ELISA試劑盒(Cat:SD0170，Lot:20190315)購自上海司鼎生物科技有限公司；小鼠CD16/32單抗(Cat:553142)購自BD公司；小鼠F4/80-PE-cy5(Cat:123110)、CD86-PE(Cat:105008)、CD206-FITC(Cat:141704)、CD11b-APC(Cat:101212)、Gr1-PE(Cat:108408)單克隆抗體購自Biolegend公司；PD-1(Cat:ab214421)、PD-L1(Cat:ab238697)蛋白Marker購自Abcam公司；PI3K(Cat:5405S)、C/EBPβ(Cat:3082S)蛋白 Marker購自CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

DMI3000B熒光倒置顯微鏡(Leica公司)；RM2235型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；HS1125型組織攤片機(jī)(浙江省金華市華速科技有限公司)；5810R型冷凍離心機(jī)(Eppendorf 公司)；F50型酶標(biāo)檢測儀(Tecan公司)；FACSVerse流式細(xì)胞儀(BD公司)；qRCR儀Stepone plus型(ABI公司)；1645050 型電泳儀(BIO-RAD 公司)；V370型掃描儀(EPSON 公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組

小鼠在動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法取8只C57BL/6小鼠分為正常組，取余下30只C57BL/6小鼠進(jìn)行造模，造模方法：取對數(shù)生長期小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，消化、離心、重懸后制備成細(xì)胞密度為5.0×106/mL的細(xì)胞懸液，取0.1 mL注射于C57BL/6小鼠尾靜脈，建立Lewis小鼠肺癌模型，接種7 d后隨機(jī)抽取6只小鼠處死剝?nèi)》谓M織，福爾馬林液中固定，鏡下觀察肺組織腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況。判斷造模成功后，余下24只小鼠隨機(jī)分為模型組、肺巖寧低劑量組、肺巖寧高劑量組，每組8只。造模成功后開始給藥干預(yù)，正常組、模型組給予生理鹽水0.4 mL灌胃，每日1次；肺巖寧低劑量組給予肺巖寧方0.4 mL 40 g/(kg· d)灌胃，每日1次；肺巖寧高劑量組給予0.4 mL肺巖寧方80 g/(kg·d)灌胃，每日1次。各組小鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)2周，末次灌胃后禁食12 h后2%異氟烷吸入麻醉，摘眼球取血，斷頸處死，迅速剝離肺組織，分別保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠肺組織病理學(xué)檢測

剝?nèi)⌒∈蠓谓M織進(jìn)行包埋、切片、脫水、染色，中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察小鼠肺組織瘤灶。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測肺組織中MDSCs、M1及M2型TAMs細(xì)胞水平

肺組織研磨后，制備小鼠肺組織單細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1 × 107/mL。取100 μL細(xì)胞懸液至標(biāo)記好的流式上樣管中，每管加入 2 μL(1 mg) CD16/CD32單抗，冰上避光封閉10 min。加紅細(xì)胞裂解液3 mL，冰上靜置20 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS 300 μL重懸細(xì)胞。一管加入F4/80-PE-cy5、CD11b-APC、CD86-PE、CD206-FITC 各 5 μL；另一管加入CD11b-FITC、Gr1-PE各5 μL，冰上避光孵育20 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS 300 μL重懸細(xì)胞，避光4 ℃保存，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

2.4 ELISA法檢測血清IL-4、IL-10濃度

1.5 mL EP管收集各組小鼠血液標(biāo)本，3 000 r/min，4 ℃離心20 min，收集血清，2～8 ℃保存，48 h內(nèi)進(jìn)行檢測。根據(jù)IL-4、IL-10試劑盒中步驟操作，樣本酶標(biāo)儀下450 nm處測吸光值(OD) 。以標(biāo)準(zhǔn)品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/mL為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，使用軟件作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)IL-4、IL-10含量。

2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

采用Trizol提取總RNA，利用紫外分析測定所抽提RNA的濃度，取1.0 μg總RNA利用TB Green qPCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為c-DNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃變性5 s，4℃保存。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，以GAPDH為內(nèi)參，小鼠iNOS上游引物：GTTCTCAGCCCAACA ATACAAGA-3’，下游引物：5’-GTGGACGGGTCGAT GTCAC；小鼠Arg上游引物：GAGCC ACCGTTTTACATT GTGA-3’，下游引物：5’-CTCGCCCACTAGGCAGTTC。反應(yīng)條件： 95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，檢測熒光信號。每樣本重復(fù)3孔，各個基因的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 Western blot檢測

每組小鼠肺組織進(jìn)行檢測，提取肺組織總蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(1∶1 000) 4 ℃過夜，TBST洗膜3次后加入二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后顯影曝光，圖像掃描。采用Image J圖像分析軟件計(jì)算條帶灰度值，將目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參灰度值對比表示目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 造模小鼠大體及肺組織HE染色結(jié)果

接種后7 d隨機(jī)挑選處死的6只小鼠中有2只小鼠肺表面有明顯肉眼結(jié)節(jié)形成，其中1只小鼠同時(shí)出現(xiàn)了肝臟遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；其余4只小鼠未發(fā)現(xiàn)肺表面肉眼結(jié)節(jié)形成，但病理HE染色鏡下可見肺內(nèi)小結(jié)節(jié)形成，腫瘤細(xì)胞形成大小不等、排列不規(guī)則的癌巢，判斷造模成功，見圖1。

注：A.解剖可見小鼠肺部肉眼瘤結(jié)節(jié)形成；B.小鼠肺表面明顯肉眼腫瘤結(jié)節(jié)形成，箭頭所示為瘤結(jié)節(jié)；C.小鼠遠(yuǎn)道肝表面轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)，箭頭所示為臟臟表面瘤結(jié)節(jié)；D.肺內(nèi)腫瘤細(xì)胞形成大小不一、排列不規(guī)則的癌巢，箭頭所示為肺組織內(nèi)癌巢形成。圖1 荷瘤小鼠大體及病理HE染色觀察

3.2 各組小鼠肺組織中MDSCs、M1及M2型TAMs細(xì)胞百分比比較

與空白組相比，模型組小鼠肺組織中M1型TAMs細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)，M2型TAMs、MDSCs百分比顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，肺巖寧低、高劑量組小鼠肺組織中M1型TAMs細(xì)胞百分比顯著上升(P<0.05)，M2型TAMs、MDSCs百分比顯著降低(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 各組小鼠肺組織TAMs、MDSCs淋巴細(xì)胞占比比較

圖2 各組小鼠肺組織中TAMs、MDSCs細(xì)胞流式圖

3.3 各組小鼠血清中IL-4、IL-10水平

與空白組相比，模型組、肺巖寧低、高劑量組小鼠血清中IL-4、IL-10水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，肺巖寧低、高劑量組小鼠血清中IL-4、IL-10水平顯著降低(P<0.05)；與肺巖寧低劑量組相比，高劑量組小鼠血清中IL-4、IL-10水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血清中細(xì)胞因子水平

3.4 各組小鼠肺組織中iNOS、Arg mRNA表達(dá)水平

與空白組相比，模型組小鼠肺組織中 iNOS mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，肺巖寧低、高劑量組小鼠肺組織中 iNOS mRNA水平顯著升高(P<0.05)。與空白組相比，模型組小鼠肺組織中Arg-1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，肺巖寧低、高劑量組小鼠肺組織中Arg-1 mRNA 水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠肺組織中iNOS、Arg-1 mRNA水平

3.5 各組小鼠肺組織中PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達(dá)水平

與空白組相比，模型組小鼠肺組織中PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達(dá)增加(P<0.05)；肺巖寧低劑量組小鼠肺組織中PD-1、PD-L1、PI3K表達(dá)增加(P<0.05)。與模型組相比，肺巖寧高劑量組小鼠肺組織中PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，肺巖寧低劑量組PD-L1表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與肺巖寧低劑量組相比，肺巖寧高劑量組小鼠肺組織中PD-L1表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 各組小鼠肺組織PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達(dá)比較

表4 各組小鼠肺組織PD-1、PD-L1、PI3K、C/EBPβ表達(dá)水平

4 討論

肺癌屬于中醫(yī)學(xué)中“肺積”“痞癖”等范疇，徐振曄教授認(rèn)為中醫(yī)藥抗腫瘤的優(yōu)勢不在于“徹底消滅”腫瘤，而在于“改造”腫瘤所處的內(nèi)外環(huán)境，即重塑腫瘤微環(huán)境[8]。中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)、辨證施治的方式，將“扶正祛邪、調(diào)和陰陽”的總體辨治思路，從“病、癥、證”的不同層面結(jié)合個體異質(zhì)性施治，多靶點(diǎn)、多途徑改善乏氧、酸中毒、慢性炎癥及免疫抑制狀態(tài)，恰恰解釋了其通過對腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)達(dá)到抑制腫瘤抗轉(zhuǎn)移的目的。肺巖寧方中生黃芪補(bǔ)氣溫陽、白術(shù)甘溫健脾，兩藥相合，補(bǔ)肺脾腎之虛；黃精益精填髓、仙靈脾合山茱萸補(bǔ)腎溫陽，三藥相合，陰陽并補(bǔ)，陰中求陽，陽中求陰；石見穿、山慈菇、露蜂房、七葉一枝花、干蟾皮解毒散結(jié)，祛邪抗癌，諸藥相合，攻補(bǔ)兼施、益氣養(yǎng)精、解毒散結(jié)。全方著眼于“正氣已虛”之本，兼顧“癌毒內(nèi)結(jié)”之標(biāo)，以益氣養(yǎng)精之法固護(hù)機(jī)體整體正氣，扶正培本，使抗邪之氣源源不竭，“養(yǎng)正積自除”，注重脾腎先后天之本，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力，并用解毒散結(jié)之品，重拳出擊，務(wù)必使邪去正安，“疏其雍滯，令上下無礙，氣血通調(diào)，則寒熱自如，陰陽調(diào)達(dá)”(《素問·至真要大論》)，攻補(bǔ)并蓄，總以調(diào)整整體氣血陰陽、臟腑功能的平衡為主，以運(yùn)動觀念貫徹整個治療過程中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺巖寧方抑制MDSCs、M2 型TAMs等TIMs的增殖，促使TAMs表型向M1型轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制MDSCs、TAMs精氨酸的合成及免疫抑制性細(xì)胞因子IL-4、IL-10的釋放，從而達(dá)到重塑腫瘤微環(huán)境、改善腫瘤免疫抑制的目的。

免疫抑制性髓樣細(xì)胞(Immunosuppressive myeloid cells)又被稱為腫瘤浸潤性髓樣細(xì)胞(Tumor-infiltrating myeloid cells, TIMs)，大量存在于實(shí)體瘤基質(zhì)中，在受到腫瘤、炎癥等刺激后被招募至腫瘤組織，分化成具有免疫抑制活性的一類髓樣細(xì)胞。典型的TIMs有MDSCs及TAMs，MDSCs是一類未分化成熟并具有免疫抑制特性的髓源性細(xì)胞，其在腫瘤組織、淋巴結(jié)或血液循環(huán)中的聚集是腫瘤逃避免疫攻擊的一個重要機(jī)制，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了有利條件[9]，在NSCLC癌患者來源的異種移植瘤模型中，MDSCs浸潤通過分泌趨化因子、誘導(dǎo)EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。MDSCs利用CD45磷酸酶活性上調(diào)引起STAT3的抑制而分化為成熟的TAMs[11],兩者均屬于異質(zhì)性程度較高的一類細(xì)胞群。TAM是腫瘤中浸潤的主要炎癥細(xì)胞，屬于固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞，具有殺傷腫瘤和促瘤生長的雙重作用，根據(jù)其功能性可分為M1型(經(jīng)典激活的M1型，Classically activated)及M2型(選擇活化的M2型，Alternatively activated)兩類，在腫瘤組織中，TAMs由抑瘤的M1型向M2型促瘤型分化，促進(jìn)Th2淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化和招募，促進(jìn)腫瘤增殖、生長、轉(zhuǎn)移、血管生成，降低機(jī)體主動免疫反應(yīng)，為腫瘤的浸潤、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移提供了適宜的免疫環(huán)境[12]。

MDSCs及M2型TAMs的免疫抑制活性主要通過對T細(xì)胞耗竭或?qū)ζ浠钚砸种瓢l(fā)揮作用，與其消耗T細(xì)胞增殖所必須的代謝物、產(chǎn)生免疫抑制性細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞功能、阻斷T細(xì)胞檢查點(diǎn)激活等機(jī)制相關(guān)。在動物模型和腫瘤患者組織中均發(fā)現(xiàn)MDSCs高表達(dá)Arg-1消耗細(xì)胞外L-精氨酸，抑制T細(xì)胞對精氨酸的利用，使T細(xì)胞上TCR缺乏CD3ζ鏈，抑制T細(xì)胞增殖及功能，通過對T細(xì)胞的耗竭發(fā)揮免疫抑制作用[13-14]。精氨酸酶和可誘導(dǎo)的iNOS存在互相競爭，在TAMs中，iNOS通過Th1型細(xì)胞因子來上調(diào)表達(dá)，而M2型TAMs通過Th2型細(xì)胞因子誘導(dǎo)釋放高活性精氨酸酶，因此在實(shí)體瘤中招募到的M2型TAMs釋放大量具有活性的精氨酸酶產(chǎn)生尿素和鳥氨酸，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明荷瘤狀態(tài)下小鼠肺組織中MDSCs及M2型TAMs大量增殖，其Arg-1 mRNA表達(dá)增高，肺巖寧方可降低小鼠肺組織中MDSCs及M2型TAMs水平及Arg-1 mRNA表達(dá)水平；同時(shí)升高M(jìn)1型TAMs水平及iNOS mRNA表達(dá)水平。

MDSCs及TAMs還可以通過產(chǎn)生免疫抑制性炎性細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制活性，這些因子初始由腫瘤細(xì)胞分泌，支持腫瘤基質(zhì)中MDSCs及M2細(xì)胞表型TAMs的募集和發(fā)育，繼而形成惡性循環(huán)，維持免疫抑制環(huán)境，存在于腫瘤進(jìn)展的全過程。IL-4、IL-10為Th2型細(xì)胞因子，通過激活STATs、PI3K信號通路誘導(dǎo)MDSCs生成及TAMs向M2型分化[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肺巖寧方能下調(diào)荷瘤狀態(tài)下小鼠外周血中IL-4、IL-10的表達(dá)，抑制MDSCs及M2型TAMs擴(kuò)增，從功能層面重塑腫瘤免疫微環(huán)境。

在腫瘤中，PD-1/PD-L1信號通路異常激活，可抑制T細(xì)胞增殖及功能活化，誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸發(fā)生，腫瘤中浸潤的髓樣細(xì)胞MDSCs及TAMs的免疫抑制活性可直接介導(dǎo)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療耐藥的發(fā)生，從而產(chǎn)生免疫抑制[18]。在小鼠模型中，選擇性抑制巨噬細(xì)胞PI3Kγ/C/EBPβ活性，可恢復(fù) CD8+T細(xì)胞活化和細(xì)胞毒性，增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療作用，抑制腫瘤生長，延長瘤鼠生存[19]，提示靶向 PI3K 通路的策略可能通過提高免疫療法療效治療腫瘤的可行性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肺巖寧方下調(diào)PD-1/PD-L1及 PI3K/C/EBPβ信號通路表達(dá)，同樣具有抑制MDSCs及M2型TAMs擴(kuò)增，誘導(dǎo)M2型TAMs向M1型轉(zhuǎn)化的改善作用。

綜上所述，肺巖寧方重塑腫瘤免疫微環(huán)境的作用體現(xiàn)在針對腫瘤形成過程中局部病灶寒熱、虛實(shí)、氣血、陰陽失調(diào)的基礎(chǔ)，把握住致病因素與機(jī)體抗邪能力之間不平衡的關(guān)系，補(bǔ)其不足，損其有余，抑制肺癌局部免疫抑制性髓樣細(xì)胞MDSCs及M2型TAMs增殖，調(diào)控M2 型TAMs重塑為具有抑瘤作用的M1型TAMs，調(diào)控其功能蛋白iNOS、Arg-1合成，下調(diào)IL-4、IL-10細(xì)胞因子水平，其內(nèi)在作用機(jī)制可能與其抑制PD-1/PD-L1及PI3K/C/EBPβ信號通路相關(guān)。肺巖寧方調(diào)節(jié)肺癌腫瘤微環(huán)境的作用是其“益氣養(yǎng)精，解毒散結(jié)”作用的一種外在具體體現(xiàn)，亟待進(jìn)一步深入探討其具體分子作用機(jī)制，為今后臨床開發(fā)奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。