李 優(yōu),南新營,李耀東

青海大學,西寧 810016

高原低氧適應是指長期生活在高原環(huán)境中的物種經(jīng)過長期的適應自然所發(fā)生的自然選擇,可以發(fā)生使其自身適應高原低氧的環(huán)境[1]。在長期自然選擇過程中留下了能適應高原環(huán)境的物種,這些動物機體發(fā)生了一些不可逆的,能穩(wěn)定遺傳的變化[2],這些變化引起了學者的注意。高原動物成為高原低氧適應研究的理想模型,很多研究人員選擇用世居于高原的動物作為研究對象[3],如喜馬拉雅旱獺、藏雞[4]、高原鼢鼠[5]、雪雞[6]等。喜馬拉雅旱獺是青藏高原地區(qū)特有的野生動物資源,具有許多平原動物不具備的生物學特性,目前對于喜馬拉雅旱獺的研究具有很高的實際意義,可以加速對高原動物的認識。

D-loop區(qū)是線粒體控制區(qū),為非編碼區(qū),此區(qū)域可以將基因突變進行累積,因此此區(qū)域是線粒體基因組變異最快和長度變異最大的區(qū)域?，F(xiàn)有研究表明,D-loop區(qū)的變異與高原低氧適應有著重要相關(guān)性[7]。

1 喜馬拉雅旱獺的生物學特征

世界上已知的旱獺種類有14種,中國有四種。在中國的四種旱獺中,喜馬拉雅旱獺是分布最廣,居住地區(qū)海拔最高的旱獺之喜馬拉雅旱獺(Marmota Himalayan)屬松鼠科(Sciuridae),嚙齒類(Rodenti),旱獺屬,是高原環(huán)境中的世居動物,也是高原環(huán)境中的特有物種,主要分布于我國青海,西藏,云南等地以及位于青藏高原邊緣山地[8]。由于喜馬拉雅旱獺長期生活在高原地區(qū),因此這一物種對于低氧的環(huán)境有很好的適應性：在高原低氧的環(huán)境中,喜馬拉雅旱獺線粒體DNA中的D-loop區(qū)發(fā)生了關(guān)于高原低氧適應的變異[9],這種變異為研究高原動物低氧適應遺傳機制奠定基礎[10]。

2 喜馬拉雅旱獺線粒體DNA D-loop區(qū)的生物學功能及結(jié)構(gòu)特征

線粒體是存在于真核細胞內(nèi)的細胞器。在生物體內(nèi),細胞的代謝水平與線粒體的數(shù)目有關(guān),生物體的代謝活動越旺盛,線粒體數(shù)目越多[11-12]。線粒體在生物體中發(fā)揮維持機體的能量代謝、調(diào)節(jié)細胞凋亡、生成活性氧等多種生物學功能[13]。

線粒體內(nèi)含有DNA,線粒體DNA是閉合,環(huán)狀的雙鏈DNA分子,是獨立的核外基因。線粒體DNA具有進化速度快,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,易于研究等特點,因此線粒體DNA是研究種群遺傳結(jié)構(gòu)的理想材料。線粒體D-loop區(qū)是mt-DNA復制與轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位,因此又被稱為線粒體控制區(qū)[14]。D-loop區(qū)在線粒體中占6%左右,是線粒體的非編碼區(qū)。不同物種D-loop區(qū)差異較大,所含有的堿基數(shù)從幾百個到幾千個不等。同一物種不同個體的D-loop區(qū)也有差異：通過近些年的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)脊椎動物的D-loop區(qū)位于編碼脯氨酸與苯丙氨酸t(yī)RNA的基因之間,飛禽類的D-loop區(qū)位于編碼脯氨酸和谷氨酸 tRNA 的基因之間。D-loop區(qū)是細胞核相互聯(lián)絡的重要區(qū)域,它既是H鏈合成的起始子,又可以將H鏈序列顯示出來,顯示出的H鏈序列易被特異分子特異性結(jié)合。

3 喜馬拉雅旱獺高原低氧適應相關(guān)基因

喜馬拉雅旱獺的完整基因序列顯示喜馬拉雅旱獺的完整mt基因組長度為16,443 bp,包含13個蛋白質(zhì)編碼基因,2個核糖體RNA(rRNA)基因,22個轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)基因和一個典型的控制區(qū)(CR)[15]。這幾種不同類型的基因及其數(shù)量與之前在大多數(shù)脊椎動物mt基因組中發(fā)現(xiàn)的相同。通過近些年對喜馬拉雅旱獺的研究,發(fā)現(xiàn)在其mtDNA中存在與高原低氧適應有關(guān)的基因有37個,有如COX1、COX2、COX3、ND1、ND2、ND3[2]、ATPase6、ATPase8等[16-17]。在這些與低氧相關(guān)機制調(diào)控有關(guān)的基因中,有8個tRNA基因和ND6基因編碼在l-鏈上,其余28個基因編碼在h-鏈上。

4 喜馬拉雅旱獺的國內(nèi)外研究進展

在線粒體DNA上,D-loop區(qū)屬于高變區(qū),生物體的變異大部分發(fā)生在此區(qū)域。高原上的生物發(fā)生的低氧適應的基礎可以基于此進行遺傳分化的研究[18-19],系統(tǒng)發(fā)育的研究以及物種間親緣關(guān)系的研究。對于喜馬拉雅旱獺的研究近些年來主要集中于以下幾方面：

4.1 喜馬拉雅旱獺起源與分化研究

在閆京艷,陳洪艦等人在青藏高原喜馬拉雅旱獺亞種分化的遺傳學證據(jù)一文中,通過對喜馬拉雅旱獺樣本進行基因與11個微衛(wèi)星標記的檢測和分析,得到了觀測雜合度大于期望雜合度的結(jié)果,等位基因在兩個群體中分布不均勻。通過最大似然法和貝葉斯推斷得出系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示所有獲得的cytb單倍型在根部以較高的支持率聚為兩個單系群,并分別對應兩個已知亞種。經(jīng)Beast分析,兩個單系群的分化時間與該屬的另外兩個種的分化時間相同?；谖⑿l(wèi)星分析檢測到兩個喜馬拉雅旱獺的單系群之間具有明顯的基因流,這表明兩個單系群之間沒有明顯的生殖隔離,其分化仍只是亞種水平[20]。該研究第一次系統(tǒng)性地證實了喜馬拉雅旱獺兩個亞種的存在[21]。

張愛萍等[22]人在對其青海地區(qū)喜馬拉雅旱獺疫源地鼠疫菌基因組時空演變及其生態(tài)適應進行分析,通過抽樣選取青海省的喜馬拉雅旱獺疫源地得到的鼠疫菌株,對其基因組型DFR數(shù)據(jù)進行分析,采用基因組分型和空間流行病學方法,繪制鼠疫菌基因組DFR時空演變專題地圖,綜合分析鼠疫菌基因組時空演變特征及其趨勢,目的是探討青海地區(qū)喜馬拉雅旱獺疫源地在鼠疫菌基因組時空演變及其影響因素,得出青海地區(qū)疫源地喜馬拉雅旱獺鼠疫菌DFR分型有較明顯的時空差異的結(jié)論。在空間尺度上喜馬拉雅旱獺的型號分布受到地區(qū)的影響。在時間尺度上,各地分離到的鼠疫菌基因組DFR型均有不同程度的種群替代。

馬懷雷等[23]在會議中指出,通過對喜馬拉雅旱獺生態(tài)學的研究,可以制定相應策略,這對于控制動物間的疫情具有重要意義。此研究用微衛(wèi)星標記法對喜馬拉雅旱獺家族之間個體的遷徙及地理之間的阻隔對遷徙的影響作了初步探索。首先采用磁珠富集篩選得到喜馬拉雅旱獺多態(tài)性微衛(wèi)星位點。通過分析得出,喜馬拉雅旱獺在自然災害面前受到的影響較小。有八個家族Fst值小于0.2,說明家族之間存在著廣泛的基因交流,未產(chǎn)生明顯的遺傳分化。

4.2 喜馬拉雅旱獺組織學研究

劉海青在喜馬拉雅旱獺血液生化指標測定一文中用喜馬拉雅旱獺血液作為研究對象。動物血液生化值可以反應器官功能等指標,因此近些年通過對于喜馬拉雅旱獺的血液生化值的研究進而為其臨床疾病的診斷與治療、動物實驗和模型建立等研究提供參考依據(jù)[24]。研究結(jié)果顯示,喜馬拉雅旱獺可用于建立人類乙肝動物模型,心血管病和肥胖病,此次研究初步建立人工飼養(yǎng)下的喜馬拉雅旱獺血液生化指標,為以后喜馬拉雅旱獺飼養(yǎng)管理及疫病監(jiān)測提供了參考依據(jù)。

在新疆喀什喜馬拉雅旱獺病毒組研究一文中,孫悅等[25]通過對新疆喜馬拉雅旱獺的腸道為研究對象,通過應用宏轉(zhuǎn)錄組法(MTT)、宏基因組法(MTG)、序列不依賴擴增法(SIA)、多重替代擴增法(MDA)對腸道樣品進行病毒基因組學研究。通過上述四種方法喜馬拉雅旱獺腸道對樣品處理,發(fā)現(xiàn)了30個科的病毒,再對這些病毒進行檢測,得到病毒組詳細信息,為人類認識動物攜帶病毒的多樣性做出了貢獻。

4.3 喜馬拉雅旱獺的實驗動物學研究

近年來,有學者已證實喜馬拉雅旱獺可以作為動物模型,在此基礎上可以研究人類乙肝病毒的發(fā)病機制,還可以通過建立實驗動物學模型,篩選出抗病毒的藥物。在動物實驗技術(shù)在喜馬拉雅旱獺實驗研究中的應用一文中,通過探索實驗動物技術(shù)在喜馬拉雅旱獺研究過程中的可操作性并進行驗證,成功建立了關(guān)于喜馬拉雅旱獺的實驗動物技術(shù)模型[26],在喜馬拉雅旱獺的研究實現(xiàn)技術(shù)上的支持。其次,范薇在國內(nèi)首次采用活體旱獺肝臟穿刺技術(shù),用于肝臟組織的提取,填補了活體旱獺肝臟穿刺獲取組織的空白[27]。

4.4 喜馬拉雅旱獺基于D-loop區(qū)的多態(tài)性及群體結(jié)構(gòu)研究

近年來,分子水平上對線粒體基因控制區(qū)即D-loop區(qū)的研究主要集中于多態(tài)性及物種的發(fā)育分析。在喜馬拉雅旱獺線粒體 DNA 控制區(qū)遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育一文中,馬英和李海龍等人對喜馬拉雅旱獺的遺傳背景進行分析,以云南、青海、西藏的旱獺作為研究對象,將獲得的線粒體D-loop區(qū)的部分基因序列進行PCR擴增,再運用遺傳學方法對獲得的樣本進行遺傳多樣性分析。喜馬拉雅旱獺在mtDNA D-loop 區(qū)積累了較豐富的變異,核苷酸變異類型豐富。在研究種群遺傳關(guān)系和結(jié)構(gòu)時用基因分化和基因流來進行評估,結(jié)果顯示不同地理環(huán)境中種族基因交流較少,出現(xiàn)明顯的基因分化。BAO Z Q等通過對原鼠群、高原鼠群、喜馬拉雅旱獺群位于D-loop區(qū)的ND3蛋白和cytB蛋白進行比較研究,發(fā)現(xiàn)喜馬拉雅旱獺群的ND3蛋白在適應高原上的生活中起著重要作用,并在分子水平上顯示出與其他高海拔動物共同進化的歷史。探索其是否有收斂進化[28]。

5 前景與展望

D-loop區(qū)在線粒體DNA中是高變區(qū)[29],在喜馬拉雅旱獺進化中自然選擇留下了可以適應高原低氧環(huán)境的變異,通過研究這些變異,對于揭示喜馬拉雅旱獺的進化以及遺傳分化有重要的價值[30]。D-loop區(qū)將為闡明喜馬拉雅旱獺的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、遺傳結(jié)構(gòu)和母體起源提供有用的信息[31-33]。為了全面了解高原動物的遺傳變異機制,還應結(jié)合其他方面如核DNA、動物體貌、染色體等。隨著學者對于D-loop區(qū)的研究,以及生物技術(shù)的發(fā)展,關(guān)于喜馬拉雅旱獺的高原低氧適應的機制與原理也會在基因水平上一步一步揭開。