邢超 徐靈巧 葉鐘泰 張志光

1深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院口腔科 518101；2中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，廣州 510055

由于軟骨缺乏血管營養(yǎng)供應(yīng)，特殊的生理特性一旦發(fā)生表層缺損難以自愈，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)病的發(fā)生［1］。隨著病變的不斷進展，關(guān)節(jié)功能退化、咀嚼功能受損，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。當(dāng)前修復(fù)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨缺損尚無有效的治療手段，如保守治療緩解疼痛，阻止病程進展，但在恢復(fù)軟骨再生方面作用有限［2-4］。自體軟骨移植，開辟第二術(shù)區(qū)造成供區(qū)缺損，且來源有限；人工關(guān)節(jié)費用高，存在并發(fā)癥，嚴(yán)格適應(yīng)癥選擇［5-6］。目前，再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)再生提供新的選擇，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchyme stem cell，MSCs）來源于體內(nèi)多種組織，包括骨髓腔、關(guān)節(jié)滑膜組織、牙周膜、牙髓組織等，在體內(nèi)外均具有軟骨分化潛能［7］。外泌體是一類直徑40～100 nm 的細(xì)胞外囊泡，攜帶核酸和蛋白質(zhì)等多種生物活性內(nèi)容物，參與細(xì)胞間信號傳遞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和信息交流。已有研究表明干細(xì)胞來源的外泌體具有與干細(xì)胞相似功能，可以輔助組織修復(fù)再生、抑制細(xì)胞凋亡、發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用［8］。干細(xì)胞來源的外泌體在腦與神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心血管系統(tǒng)、肝臟損傷、腎臟損傷、骨骼與肌肉系統(tǒng)等方面表現(xiàn)出強大的修復(fù)和再生能力，甚至能夠替代干細(xì)胞開啟“無細(xì)胞”治療［9-12］。蛋白多糖是軟骨細(xì)胞生長代謝、發(fā)揮功能的一個重要指標(biāo)［13］。本研究旨在探索外泌體與髁突軟骨細(xì)胞蛋白多糖之間的關(guān)系，觀察在外泌體的作用下，髁突軟骨細(xì)胞單位DNA 中氨基聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的含量及基因表達，從而為外泌體修復(fù)髁突軟骨缺損提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1、 材料與試劑 研究時間為2019年1月至2021年1月（其中動物實驗部分2014年做）。實驗用100 g左右SPF級雄性SD 大鼠，動物由中山大學(xué)北校區(qū)動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2011-0029，實驗方法符合動物倫理學(xué)要求。鯊魚硫酸軟骨素（Sigma，美國）；FBS（Gibico，美國）；Anti-Collagen Type I Rabbit pAb（Calbiochem?，德國）；Anti-Collagen II（SIGMA-ALDRICHTM，美國）；DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit gG（H+L）（ EARTHoX.LLC，美國）；小牛胸腺 DNA（Sigma，美國）；L-cysteine（Sigma，美國）；Hoechst 33258（Sigma，美 國）；TRIzol? Reagent（Ambion，美國）；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche，瑞士）；SYBR Green Mix（Roche，瑞 士）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，美國）；倒置顯微鏡下（Axiovert 40，Zeiss，德國）RT-PCR Primer（Invitrogen，美國）；Real-time PCR 儀（Roche，德國）；全自動酶標(biāo)儀（Tecan Infinite200，瑞士）。

1.2 細(xì)胞獲取與鑒定

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的獲取及鑒定 從大鼠腹腔注入1%戊巴比妥鈉麻醉劑0.5 ml，手術(shù)分離雙側(cè)下肢股骨，去除骨頭兩側(cè)的骨骺端，使用含10%FBS的a-MEM 沖洗骨髓腔，將沖洗出的液體置于25 cm2無菌的培養(yǎng)瓶中，48 h 后換液將未貼壁的血細(xì)胞沖洗去掉。每隔3～4 d換液1次，細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的80%后1∶3傳代。分別進行成骨、成脂及成軟骨誘導(dǎo)，驗證其多向分化能力。

1.2.2 大鼠髁突軟骨細(xì)胞的獲取及鑒定 在麻醉狀態(tài)下，將髁突及其附著物取出［14］。切取半透明的軟骨中央部分，放入0.25%的胰酶的培養(yǎng)瓶中消化30 min（每5～10 min震蕩混勻1 次），0.2%II 型膠原酶消化3 h，將所有收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm2無菌的培養(yǎng)瓶中，10% FBS 的低糖型培養(yǎng)基（L-DMEM）培養(yǎng)，每隔3～4 d 換液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80%后傳代。將獲取的細(xì)胞進行II型膠原抗體免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 外泌體的提取、鑒定及分組 培養(yǎng)皿中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞量達到80%時，去除上清液并加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，收集上清液。在4 ℃條件下，進行差速離心：2 000 g離心 30 min，20 000 g 離心60 min，100 000 g 離心60 min，收集離心管底部沉淀，PBS 稀釋，100 000 g 離心 60 min，100 μl PBS 重懸沉淀物，放入-80 °C 冰箱保存?zhèn)溆?。透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，納米顆粒追蹤分析外泌體粒徑，蛋白印跡檢測外泌體標(biāo)記物。取P1 代髁突軟骨細(xì)胞置于不含F(xiàn)BS 的 L-DMEM 培養(yǎng) 24 h，實驗組加入 100 μl 包含外泌體的PBS，對照組加入100 μl PBS，分別置于37 ℃，含5%二氧化碳，95%空氣飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周換液2～3次。

1.4 髁突軟骨細(xì)胞GAG 含量測定 取100 μl 質(zhì)量濃度分別為：20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml 鯊魚硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)液，空白對照組加入ddH2O，每孔各加入2 ml 二甲基亞甲藍（DMMB）混勻，酶標(biāo)儀525 nm下測吸光度值，繪制GAG 含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線［15］。以鯊魚硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為Y，吸光度值為X，做線性回歸得一標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（Y=a·X+b，a、b為常數(shù)）。

取兩組髁突軟骨細(xì)胞，加入1 ml 的木瓜蛋白酶60 ℃水浴箱過夜（＞16 h）。取100 μl消化液（每個樣本設(shè)置3個平行對照組），加入2 ml DMMB，酶標(biāo)儀525 nm下測吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出細(xì)胞內(nèi)GAG 含量，細(xì)胞內(nèi)GAG 含量=a·吸光度值+b。

1.5 髁突軟骨細(xì)胞DNA 含量測定 取牛胸腺DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋成0、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml溶解于TNE緩沖液中，取40 μl不同濃度的牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)液加入到 96 孔板。室溫避光條件下加入 Hoechst 33258（10 μg/ml）160 μl，熒光酶標(biāo)儀下測 excitation 358 nm 、emission 458 nm吸光度值［16］。以牛胸腺DNA 標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為Y，吸光度值為 X，做線性回歸得一標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（Y=a·X+b，a、b 為常數(shù)）。

取兩組髁突軟骨細(xì)胞，加入1 ml 的木瓜蛋白酶60 ℃水浴箱過夜（＞16 h）。取40 μl 消化液，加入160 μl Hoechst 33258（10 ug/ml），熒 光 酶 標(biāo) 儀 下 測 excitation 358 nm 、emission 458 nm 吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出細(xì)胞內(nèi)DNA含量（細(xì)胞內(nèi)DNA含量=a·吸光度值+b）

1.6 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 按2×105/瓶接種P1 代髁突軟骨細(xì)胞至25 cm 培養(yǎng)瓶，Trizol 分別提取培養(yǎng)7、14 d 髁突軟骨細(xì)胞RNA 并測定濃度。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBRGreen QPCR Master Mix 試劑盒進行定量PCR。結(jié)果分析按照Livak 等［17］的方法計算實驗組與對照組相對CT 值（2-△△Ct），每個樣本重復(fù) 3 次，采用 GAPDH 作為管家基因，分析GAG 基因表達情況，基因引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成（表1）。

表1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17.0 軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng) 計 分 析 ，計 量 資 料 以 均 數(shù) ±標(biāo) 準(zhǔn) 差（）表 示 ，Shapiro-wilk 檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性，若方差齊、符合正態(tài)分布采用獨立樣本t檢驗，方差不齊或偏態(tài)分布采用Mann.Whitney test 非參數(shù)檢驗法。每組實驗重復(fù)3 次，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05，P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs 的培養(yǎng)及多向分化能力鑒定 利用干細(xì)胞貼壁生長的特性，可見部分小圓形細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基表面，貼壁細(xì)胞大小不等，多為短梭形，核橢圓形，有的可呈雙核（圖1-A）。成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞周圍可見有鈣化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色可見紅色鈣化結(jié)節(jié)形成（圖1-B）。成脂誘導(dǎo)組細(xì)胞周圍可見大量脂滴形成，油紅O 染色低倍鏡下觀察可見大量紅色脂滴形成（圖1-C）。軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)3周后，可見有乳白色軟骨塊形成（圖1-D）。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及三向分化能力。A 為顯微鏡下BMSCs 形態(tài)（50 倍放大）；B 為成骨誘導(dǎo)茜素紅染色（50 倍放大）；C 為成脂誘導(dǎo)油紅O 染色（50 倍放大）；D 為成軟骨誘導(dǎo)形成的軟骨塊

2.2 大鼠髁突軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 髁突軟骨細(xì)胞成簇分布，形態(tài)多角形，隨著細(xì)胞數(shù)量密集，細(xì)胞形態(tài)成圓形或多邊形，逐漸融合形成“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)（圖2-A）。激光共聚焦顯微鏡下，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)II 型膠原呈綠色熒光表達，藍色為細(xì)胞核DAPI染色（圖2-B）。

圖2 髁突軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及II 型膠原熒光染色。A 為大鼠髁突軟骨細(xì)胞形態(tài)（50 倍放大）；B 為II 型膠原免疫熒光（200倍放大）

2.3 外泌體鑒定 透射電鏡下觀察BMSCs-外泌體形態(tài)和大?。▓D3 A）：外泌體結(jié)構(gòu)完整，呈圓形囊泡狀，伴有“茶托樣”特征外形。納米顆粒追蹤分析（圖3 B）：所提取的BMSCs-外泌體粒子直徑眾數(shù)87 nm，平均直徑100 nm，提示成功提取到BMSC-外泌體。Western blot 檢測（圖3 C）：外泌體特異性標(biāo)記蛋白CD9 和TSG101 的表達，但不表達3-磷酸甘油醛脫氫酶。

圖3 外泌體的鑒定。A 為透射電鏡下觀察外泌體結(jié)構(gòu)完整；B為納米顆粒追蹤分析；C為Western blot顯示，外泌體表面標(biāo)志物CD9、TSG101呈陽性表達，但不表達3-磷酸甘油醛脫氫酶

2.4 細(xì)胞GAG 含量測定 鯊魚硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度X 對其吸光度Y 作線性回歸，擬合一標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.01X-0.3814，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7。結(jié)果表明吸光度總變異的99.67%與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度有關(guān)，具體見圖4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出細(xì)胞內(nèi)GAG含量，實驗組GAG含量在第3天高于對照組［（0.95±0.03）μg/ml 比（0.58±0.02）μg/ml］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.36，P＜0.001）；第7 天實驗組高于對照組［（2.68±0.06）μg/ml 比（1.63±0.04）μg/ml］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.01，P＜0.001）；第14 天實驗組高于對照組［（3.59±0.07）μg/ml 比（1.86±0.07）μg/ml］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.61，P＜0.001）。

圖4 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 細(xì)胞DNA 含量測定 牛胸腺DNA 溶液的質(zhì)量濃度X 對其吸光度Y 作線性回歸，擬合一標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=1.929 9X-727.77，相關(guān)系數(shù)R2=0.971 3。結(jié)果表明，吸光度總變異的97.13%與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度有關(guān)，具體見圖5。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出細(xì)胞內(nèi)DNA含量，第3天實驗組DNA含量顯著高于對照組［（30.14±9.59）μg/ml比（23.45±3.33）μg/ml］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.625，P=0.037）；第7 天實驗組與對照組基本一致［（42.82±3.74）μg/ml 比（40.46±7.01）μg/ml］，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.447，P＞0.05）；第14 天實驗組與對照組基本一致［（54.70±1.36）μg/ml 比（54.70±1.80）μg/ml］，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.286，P＞0.05）。

圖5 牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 單位DNA 中GAG 含量測定（GAG/DNA） 第 3 天GAG/DNA 含量實驗組高于對照組［（0.0320 ±0.007 1）比（0.023 0±0.003 5）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.921，P=0.018）；第 7 天實驗組高于對照組［（0.063 0±0.006 5）比（0.039 0±0.006 7）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.78，P＜0.001）；第14 天實驗組高于對照組［（0.063 0±0.007 3）比（0.032 0±0.005 8）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.59，P＜0.001）。結(jié)果表明實驗組中的外泌體可以促進軟骨細(xì)胞單位DNA中GAG含量表達。

2.7 RT-PCR 檢測細(xì)胞中GAG 基因的表達水平 第7 天GAG mRNA 的含量表達水平實驗組高于對照組［（2.610±0.018）比（1.000±0.150）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.31，P＜0.001）；第14天實驗組高于對照組［（5.560±0.018）比（2.550±0.090）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.78，P＜0.001）。結(jié)果表明實驗組中的外泌體可以促進軟骨細(xì)胞GAG 基因表達。

3 討論

干細(xì)胞來源的外泌體在各個領(lǐng)域均有應(yīng)用，作為MSCs分泌物的主要成份，在組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。目前外泌體的提取方法主要有：超速離心法、密度梯度離心法、聚合沉淀法、超濾法、免疫捕獲法等。這些方法均具有含量低或純度低等缺點，缺乏統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。提取方法并非本實驗的研究重點，因此按照國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會提出方法為指導(dǎo)提取外泌體［18-19］。

蛋白多糖是一類由核心蛋白與GAG 以共價和非共價鍵所組成的糖復(fù)合物，其含糖量可高達95%以上。氨基聚糖通過一個或多個共價鍵與羧基（-COOH）、硫酸基（-OSO3H）和磺基（-SO3H），重要的GAG 有透明質(zhì)酸（HA）、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)酸、硫酸皮膚素、硫酸肝素等［13］。按照蛋白聚糖的組織分布和功能分為3 類：（1）細(xì)胞膜PG，各種組織均有表達，與生理功能合病理變化有關(guān)；（2）基底膜結(jié)合PG，主要在血管上皮細(xì)胞基底膜，調(diào)節(jié)血管分化和調(diào)控腫瘤發(fā)展有關(guān)；（3）細(xì)胞外基質(zhì)PG，主要功能維持細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，最常見的是多聚蛋白聚糖（aggrecan，AG），與HA充填于軟骨細(xì)胞間隙，是關(guān)節(jié)軟骨主要成份［20］。

通過RT-PCR 檢測軟骨相關(guān)基因的表達水平，GAG 的含量在第7、14 天時，實驗組均明顯高于對照組，表明BMSCs-外泌體中含有的生物活性因子通過促進GAG 基因的表達。有學(xué)者在兔子骨關(guān)節(jié)病模型中，通過關(guān)節(jié)腔注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)來源的外泌體聯(lián)合HA，術(shù)后進行組織學(xué)和免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)外泌體可以促進蛋白聚糖的合成進而加快軟骨損傷的修復(fù)，并且新形成的軟骨組織與天然軟骨具有相近的機械性能［21］。

為了進一步檢測軟骨細(xì)胞中GAG 含量的表達情況，我們通過分析細(xì)胞內(nèi)的蛋白多糖含量，實驗組第3、7、14 天均明顯高于對照組，說明BMSCs-外泌體促進蛋白多糖表達，這些結(jié)果與上述RT-PCR 結(jié)果一致。為了排除細(xì)胞數(shù)量增加的干擾，我們檢測單位DNA 中GAG 含量表達的變化，結(jié)果顯示第7、14 天時實驗組GAG/DNA 含量明顯高于對照組。所有的這些證實了BMSCs-外泌體促進軟骨細(xì)胞GAG含量的表達，對維持軟骨的表型發(fā)揮重要的作用。這與Zhang 等［22］將 MSCs 來源的外泌體與軟骨共培養(yǎng)，促進軟骨基質(zhì)合成，植入動物缺損模型后促進軟骨缺損愈合結(jié)果一致。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)外泌體中的一些miRNA 可以調(diào)控軟骨基質(zhì)合成，比如 miR-125b 和 miR-320 通過下調(diào) aggrecanse 和MMP-13 表達，從 而 減 輕 ECM 破壞，miR-92a 可以通過PI3K/AKT/mTOR 通路靶向noggin 3 上調(diào)軟骨基質(zhì)合成，介導(dǎo)MSC外泌體促進軟骨修復(fù)［23-24］。

綜上所述，干細(xì)胞來源的外泌體增加單位DNA 中GAG含量表達，有助于增加髁突軟骨細(xì)胞的蛋白多糖表達，這將為顳下頜骨關(guān)節(jié)病的治療開辟新的思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。