楊勇衛(wèi) 陳錫蓮 曲人亮 張帥 劉友德 鄒志強(qiáng) 李彩東

1山東省煙臺(tái)市奇山（傳染?。┽t(yī)院檢驗(yàn)科 246001；2蘭州市第二人民醫(yī)院肝病研究所 730046

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染至今仍是全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題，全球約有3.5億乙型肝炎表面抗原攜帶者。我國有近1 億人感染HBV 病毒，乙型肝炎表面抗原攜帶率高達(dá)7.18%，極大影響公眾健康，且加重衛(wèi)生系統(tǒng)負(fù)擔(dān)［1］。HBV 持續(xù)大量復(fù)制，肝細(xì)胞反復(fù)受損，肝臟長期處于慢性炎癥狀態(tài)，病情進(jìn)一步發(fā)展為慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC），甚至肝癌（HCC）［2］。輔助性T淋巴細(xì)胞17（Th17）與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）作為兩類新型T淋巴細(xì)胞亞群，分別具有抗炎及促炎作用。研究指出，Th17/Treg失衡及其細(xì)胞因子可能導(dǎo)致肝臟免疫炎癥加重或加速HBV感染慢性化［3-4］。高爾基體糖蛋白-73（Golgi protein-73，GP73）是位于高爾基體的一種跨膜蛋白，在肝癌組織中呈特異性高表達(dá)［5］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth fator，VEGF）是目前所知的最強(qiáng)的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，其mRNA 水平和蛋白水平在HCC 細(xì)胞中均有過量表達(dá)［6］。但目前關(guān)于 Th17/Treg 細(xì)胞因子、VEGF、GP73在HBV感染慢性化進(jìn)程中的作用研究報(bào)道尚不多見，本研究本通過分析CHB、LC 和HCC 患者外周血Th17/Treg細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平，旨在探討以上因子在HCC 的發(fā)病機(jī)制中扮演的角色，從而為臨床治療慢性乙型肝炎和原發(fā)性HCC的早期診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對照組：40 例健康對照者為2018 年9月至2020年5月煙臺(tái)市奇山醫(yī)院體檢中心健康查體者，排除各型肝炎病毒感染，排除心肺疾病等，肝功能正常；年齡23～58（39.15±14.95）歲，其中男性25例，女性15例。

試驗(yàn)組：114例患者均為2018年9月至2020年5月在煙臺(tái)市奇山醫(yī)院住院及肝病專家門診收治的HBV 感染者，原發(fā)性HCC 患者 32 例（HCC 組），乙型肝炎LC 患者31 例（LC組），CHB 患者51 例（CHB 組）。所有患者排除甲、丙、丁、戊等肝炎病毒感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎等疾病。其中男性76 例，女性38 例，年齡11～73（43.38±12.72）歲；診斷符合2015 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染學(xué)會(huì)聯(lián)合制定的《慢性乙型肝炎診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。

本研究經(jīng)煙臺(tái)市奇山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（煙臺(tái)市奇山醫(yī)院倫準(zhǔn)202004 號(hào)），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 細(xì)胞因子檢測方法 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），試劑盒購自中國上海朗頓生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說明書要求操作，使用科華ST-360酶標(biāo)儀檢測。

1.2.2 VEGF、GP73 檢測方法 試劑及廠家：中國上海朗頓生物科技有限公司（ELISA 檢測試劑盒），上述均嚴(yán)格按照儀器、試劑盒說明書操作。

1.2.3 HBV DNA 檢測方法 無菌采集3組研究對象空腹血清標(biāo)本2.0 ml，注入無菌離心管，室溫保存2 h，1 600 r/min離心5 min（離心半徑15 cm），吸取離心管中血清200 μl，轉(zhuǎn)入另一無菌1.5 ml 離心管。最后取5 μl 血清，用于DNA 提取。采用美國ABI-7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分析儀進(jìn)行基因擴(kuò)增，試劑購自中國廣州達(dá)安生物科技有限公司。結(jié)果判斷：＜102IU/ml 為陰性，102～104IU/ml 為低載量組，105～106IU/ml為中載量組，＞107IU/ml為高載量組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間方差不齊采用Welch 方差分析，兩兩比較采用Games- Howell 檢驗(yàn)，多組間及進(jìn)一步兩兩比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析法，相關(guān)系數(shù)用r表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床基本資料 健康對照組共40 例，男25 例，女15例，年齡（39.15±14.95）歲。共納入患者114例，CHB 組中男35例，女16例，年齡（35.02±13.49）歲；LC組中男19例，女12 例，年齡（49.50±12.31）歲；HCC 組中男 22 例，女10 例，年齡（53.15±11.03）歲。研究發(fā)現(xiàn)，隨著病情進(jìn)展，患者年齡逐年增大，且男性患者占多數(shù)。慢性HBV 感染者組ALT、AST、HBV DNA 水平與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 不同臨床分型HBV 感染者細(xì)胞因子表達(dá)水平分析 本研究結(jié)果顯示，隨著病情的發(fā)展，3 組患者血清細(xì)胞因子表達(dá)水平均顯著升高；與健康對照組相比，CHB 組、LC組和HCC 組外周血IL-6水平均顯著升高，且試驗(yàn)組中HCC組水平最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與健康對照組相比，CHB 組、LC 組和 HCC 組外周血 IL-10 水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；HBV 感染者中CHB 組 IL-10 水平最低，與 LC 組和 HCC 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與健康對照組相比，CHB 組、LC組和HCC 組外周血IL-17 水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與健康對照組相比，CHB 組、LC 組和HCC 組外周血TGF-β 水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 慢性乙型肝炎病毒感染者及健康對照組健康查體者細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（）

表2 慢性乙型肝炎病毒感染者及健康對照組健康查體者細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（）

注：CHB 為慢性乙型肝炎，LC 為肝硬化，HCC 為肝癌。Th17 為輔助性T淋巴細(xì)胞17，Treg 為調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。IL 為白介素，TGF-β 為轉(zhuǎn)化生長因子-β。與健康對照組相比，aP＜0.05；與CHB組相比，bP＜0.05；與LC組相比，cP＜0.05

TGF-β 47.38±4.63 250.21±45.45a 316.22±50.21ab 166.22±38.65abc 5.88＜0.05組別健康對照組CHB組LC組HCC組F值P值例數(shù)40 51 31 32 Th17細(xì)胞因子IL-6 25.79±5.41 80.93±10.87a 76.26±10.57a 52.14±3.06ab 4.56＜0.05 IL-17 4.35±2.22 20.73±6.64a 23.37±15.08a 16.03±8.74a 2.12＜0.05 Treg細(xì)胞因子IL-10 12.93±4.63 184.68±58.97a 356.56±150.77ab 287.89±88.83abc 6.21＜0.05

2.3 不同臨床分型HBV 感染者VEGF、GP73 表達(dá)水平分析 研究發(fā)現(xiàn)：VEGF 和GP73 表達(dá)水平隨患者病情惡化逐漸升高，且均在HCC 組患者中表達(dá)水平最高。與健康對照組相比，CHB 組、LC組和HCC 組外周血GP73水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 HCC 患者外周血細(xì)胞因子與VEGF 和GP73 水平的相關(guān)性分析 HCC 患者外周血IL-17 和IL-10 表達(dá)水平與VEGF水平呈正相關(guān)（r=0.247、0.286，均P＜0.05），其余均無相關(guān)性（均P＞0.05）。見表4。

表4 32例肝癌患者外周血細(xì)胞因子與VEGF和GP73水平的相關(guān)性分析

3 討 論

HBV 感染后慢性化的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，眾多學(xué)者認(rèn)為HBV 感染肝細(xì)胞后并不直接損傷細(xì)胞，而是由免疫介導(dǎo)炎性反應(yīng)來損害肝細(xì)胞。先前的研究多集中在CD4+T淋巴細(xì)胞Th1/Th2平衡和失調(diào)［8］。近年深入研究發(fā)現(xiàn)：HBV持續(xù)感染也存在Th17與Treg失衡［9］。但目前關(guān)于Th17/Treg細(xì)胞因子結(jié)合VEGF、GP73 在HBV 感染慢性化進(jìn)程中的作用研究鮮見報(bào)道。CD4+T 淋巴細(xì)胞可分化出Th17 和Treg 兩類細(xì)胞，Th17 激活后可分泌 IL-6、IL-17、IL-21、IL-22 等細(xì)胞因子，具有活化中性粒細(xì)胞等作用，可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、激活炎性細(xì)胞、促炎作用［10-11］；Treg 分泌的細(xì)胞因子以 IL-4、IL-10 和TGF-β 為主，在機(jī)體中表現(xiàn)為抗炎、免疫抑制和維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性［12］。本研究通過統(tǒng)計(jì)患者基本資料發(fā)現(xiàn)，隨著病情的進(jìn)展，患者年齡逐年增大，且男性患者占多數(shù)。慢性 HBV 感染者 ALT、AST、HBV DNA 水平與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。有研究報(bào)道，慢性重癥乙型肝炎患者Th17/Treg 失衡與慢性HBV 感染者肝損傷呈正相關(guān)，表明Th17/Treg 恢復(fù)平衡可減輕肝損傷［13］。因此，調(diào)節(jié)二者平衡并維持促炎與抗炎的狀態(tài)有利于病情好轉(zhuǎn)，且為臨床提供了靶向治療的依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)：與健康對照組相比，CHB 組、LC 組和HCC 組外周血IL-6、IL-17、IL-10和TGF-β水平均顯著升高（均P＜0.05），提示這4 種細(xì)胞因子參與了肝病的相關(guān)進(jìn)程以及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，與乙型肝炎的發(fā)病和病情進(jìn)展密切相關(guān)。有研究顯示，外周血Th17/Treg 與LC 的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；上述研究與本研究基本一致，說明Th17/Treg 失衡在嚴(yán)重肝病發(fā)生中具有重要作用，Th17 過度分化可能加重肝細(xì)胞免疫損傷，而Treg 反應(yīng)性升高又將致使HBV 免疫清除受到抑制，導(dǎo)致不可逆的肝損傷［14-15］。

表1 慢性乙型肝炎病毒感染者及健康對照組健康查體者臨床基本資料比較

表3 慢性乙型肝炎病毒感染者及健康對照組健康查體者外周血VEGF和GP73水平比較

VEGF 是目前所知的最強(qiáng)的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，能直接或間接參與血管形成，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中具有極其重要的作用［16］。GP73 是近期發(fā)現(xiàn)的與病毒性肝炎及以此為基礎(chǔ)的HCC 關(guān)系密切的糖蛋白［17-18］；本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性HBV 感染相關(guān)的HCC 中，與健康對照組相比，CHB 組、LC組和HCC 組外周血GP73水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。VEGF 在HCC 組患者中表達(dá)水平最高。這提示感染HBV 的患者血清VEGF、GP73 表達(dá)水平普遍上調(diào)。這說明HCC 血清VEGF 水平可以在一定程度上反映HCC 病情并證實(shí)在HCC 生長、發(fā)展過程中具有重要作用。在HCC 進(jìn)展的各階段，癌組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生活躍，細(xì)胞表面的VEGF 表達(dá)明顯上調(diào)，癌組織中的血管生成對于腫瘤的生物侵襲性有著重要影響。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，GP73 在HCC 組患者的表達(dá)水平最高，在LC組中表達(dá)次之，與CHB 組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示其可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定的作用，除與HCC 的發(fā)生有關(guān)之外還與肝臟炎癥及纖維化程度有關(guān)，因此當(dāng)GP73水平升高時(shí)需要排除肝臟纖維化進(jìn)展期和急性炎癥期。在上述研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HCC 患者外周血 IL-17 和 IL-10 表達(dá)水平與 VEGF 水平呈正相關(guān)（r=0.247、0.286，均P＜0.05），表明 IL-17、IL-10、VEGF 參與了肝病的相關(guān)進(jìn)程以及原發(fā)性HCC 的發(fā)生發(fā)展，可作為HCC的監(jiān)測因子，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情惡化。

綜上所述，Th17/Treg 平衡是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。本研究證實(shí)，HBV 感染機(jī)體后，IL-6、IL-17、IL-10 和TGF-β與VEGF、GP73相互作用，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，推動(dòng)了乙型肝炎的發(fā)生和發(fā)展，對具體作用及機(jī)制有待我們進(jìn)一步做深層次的研究和探討，將有助于尋求更好的治療方法，發(fā)展新型的、更適合臨床的免疫調(diào)節(jié)治療方法。聯(lián)合檢測可作為評估慢性乙型肝炎病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，有助于提高診斷率，特別是早期HCC 患者，具有較大的補(bǔ)充價(jià)值，并有望成為慢性肝病治療的新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。