朱鐘鐘 姜進(jìn)平 黃耿 羅海平 湯守元

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸肛腸外科，黃石 435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，黃石 435000

胃癌是最常見(jiàn)的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)［1］。胃癌易轉(zhuǎn)移且其早期癥狀不明顯，大部分患者臨床確診時(shí)已在中晚期，治療效果有限，5 年生存率很低［2］。由此，探究胃癌的分子治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物是胃癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）由前體pre-microRNA 經(jīng)過(guò)剪切生成，起初被認(rèn)為不具有特定生物學(xué)功能，是基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的副產(chǎn)物［3］。越來(lái)越多研究表明，miRNA 與腫瘤的產(chǎn)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸顯著相關(guān)［4-5］。微小RNA-1322（miR-1322）被證實(shí)在多種腫瘤（如肝癌、食管鱗癌、肺腺癌等）組織或細(xì)胞株中低表達(dá)，以不同的作用機(jī)制抑制癌癥的發(fā)生和進(jìn)展，可能與癌癥患者的預(yù)后相關(guān)［6-7］。miR-1322 在 胃 癌 中 鮮 有 報(bào) 道 ，于 2020 年 8 月 至 2021 年6 月，本研究通過(guò)慢病毒感染上調(diào)SGC7901 細(xì)胞miR-1322 的表達(dá)，觀察其對(duì)胃癌SGC7901 細(xì)胞遷移及凋亡的影響，探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 胃癌SGC7901 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司；慢病毒（GV112）購(gòu)于上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；Transwell 小室購(gòu)于美國(guó)Corning 公司；一抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白3（caspase 3）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白8（caspase 8）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、瞬時(shí)受體電位香草酸4（TRPV4）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志的二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和感染 SGC7901 細(xì)胞接種在含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2）中培養(yǎng)。將SGC7901 細(xì)胞接種在六孔板，根據(jù)慢病毒感染說(shuō)明書(shū)（感染復(fù)數(shù)為20），細(xì)胞匯合度為60%時(shí)感染，分為2 組：對(duì)照組感染空白慢病毒，miR-1322 組感染miR-1322 慢病毒載體。感染8 h后更換新的培養(yǎng)基，采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染的SGC7901細(xì)胞株。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-1322 的靶基因 用PicTar（https：//pictar.mdc-berlin.de/）預(yù)測(cè) miR-1322 的靶基因，TRPV4可能是miR-1322的靶基因。

1.4 qRT-PCR 檢 測(cè) miR-1322 和 TRPV4 mRNA 的 表達(dá) 待感染后的SGC7901 細(xì)胞匯合度達(dá)70%，TRIzol 法提取SGC7901 細(xì)胞株總RNA。定量RNA 純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄RNA 為cDNA。測(cè)定miR-1322相對(duì)表達(dá)以U6為內(nèi)參，測(cè)定TRPV4 mRNA 相對(duì)表達(dá)以GAPDH 為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，運(yùn)用2-ΔΔCt方法計(jì)算結(jié)果。引物序列如下，miR-1322 正向引物：5’-GATGATGCTGCTGATGCTG-3’，反 向 引 物 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；TRPV4 正向引物：5’-CTACGGCACCTATCGTCACC-3’，反向引物5’-TTAGGCGTTTCTTGTGGGTCA-3’。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SGC7901 細(xì)胞的凋亡 收集胰蛋白酶消化的SGC7901 細(xì)胞，使用重懸2 組細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC 試劑和PI 染液，充分混合均勻，在4 ℃下避光放置35 min。加入Annexin V-FITC 結(jié)合液，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SGC7901細(xì)胞凋亡的情況。

1.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC7901 細(xì)胞的遷移能力將2 組SGC7901 細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，收集胰蛋白酶消化的SGC7901 細(xì)胞，將200 μl 無(wú)血清細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，將700 μl完全培養(yǎng)基加至Transwell小室下室，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h。通過(guò)4%多聚甲醛固定SGC7901細(xì)胞，通過(guò)結(jié)晶紫染液染色SGC7901 細(xì)胞。通過(guò)PBS 溶液充分洗滌，在100倍倒置顯微鏡下拍照。

1.7 Western blot 檢測(cè)TRPV4 基因蛋白表達(dá) 提取2 組 SGC7901 細(xì)胞總蛋白并測(cè)蛋白濃度，每孔加入 40 μg 蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜2.0 h。9%脫脂牛奶封閉1.5 h。根據(jù)不同蛋白分子量裁剪條帶，于一抗中保存過(guò)夜。于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志的二抗中保存3.5 h。根據(jù)1∶1 比例制備ECL 發(fā)光液，在曝光儀內(nèi)曝光、顯影和拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-1322 在SGC7901 細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)情況 對(duì)照組和miR-1322 組miR-1322 的表達(dá)分別為（1.01±0.07）和（12.96±1.05），miR-1322 組 miR-1322 表 達(dá) 是 對(duì) 照組 的12.83 倍（t=6.30，P＜0.01），提示感染miR-1322 慢病毒載體成功。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-1322 促進(jìn)SGC7901 細(xì)胞的凋亡 細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示（圖1），對(duì)照組和miR-1322 組SGC7901 細(xì)胞凋亡比例分別為（6.95±1.02）%和（32.88±6.22）%。與對(duì)照組相比，miR-1322組SGC7901細(xì)胞凋亡比例明顯增加（t=4.11，P＜0.01），說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-1322后SGC7901細(xì)胞凋亡增加。

圖1 過(guò)表達(dá)miR-1322對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡的影響（A為對(duì)照組，感染空白慢病毒載體；B為miR-1322組，感染胃癌SGC7901細(xì)胞）

2.3 過(guò)表達(dá)miR-1322 抑制SGC7901 細(xì)胞的遷移 如圖2，對(duì)照組和miR-1322 組SGC7901 細(xì)胞遷移數(shù)分別為（107.30±10.94）個(gè)和（43.44±8.04）個(gè)。與對(duì)照組相比，miR-1322 組 SGC7901 細(xì)胞遷移數(shù)顯著降低（t=4.28，P＜0.01），說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-1322后SGC7901細(xì)胞遷移減少。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-1322對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移的影響（A為對(duì)照組，感染空白慢病毒載體；B為miR-1322組，感染胃癌SGC7901細(xì)胞）

2.4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-1322 的靶基因 用PicTar軟件預(yù)測(cè) miR-1322 的靶基因，TRPV4 可能是 miR-1322 的靶基因，miR-1322與TRPV4基因的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3。

圖3 miR-1322與TRPV4基因的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)

2.5 過(guò)表達(dá)miR-1322 抑制SGC7901 細(xì)胞中TRPV4 mRNA 表達(dá) 對(duì)照組和 miR-1322 組 SGC7901 細(xì)胞中TRPV4 mRNA 的表達(dá)分別為（1.01±0.09）和（0.26±0.03），與對(duì)照組相比，miR-1322組SGC7901細(xì)胞TRPV4 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），說(shuō)明 miR-1322 負(fù)調(diào)控 TRPV4 mRNA 的表達(dá)。

2.6 TRPV4 蛋白和凋亡及遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot 結(jié)果表明（圖 4），miR-1322 組 SGC7901 細(xì)胞TRPV4 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞凋亡蛋白caspase 3、caspase 8表達(dá)增加，細(xì)胞遷移蛋白β-catenin表達(dá)降低。

圖4 miR-1322對(duì)TRPV4蛋白和凋亡、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

越來(lái)越多的miRNA 被發(fā)現(xiàn)與胃癌細(xì)胞的惡性行為密切相關(guān)［8-9］。如miR-146b-5p 在胃癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織，在合并淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者中可見(jiàn)更低水平的miR-146b-5p，體外過(guò)表達(dá)miR-146b-5p 減弱了胃癌細(xì)胞的增殖和遷移潛能［10］。Shi等［11］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體源性的miR-1246 在胃癌患者和健康對(duì)照人群血清中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-1246 可能成為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物。miR-1322 是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，不具有編碼蛋白的功能［6］。Zhao 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，miR-1322 能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。Wu等［6］研究發(fā)現(xiàn)，miR-1322通過(guò)誘導(dǎo)自噬，增強(qiáng)?？颂婺崮退幍姆蜗侔┘?xì)胞對(duì)?？颂婺岬拿舾行?。miR-1322 在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制并不清楚，其可能作為抑癌因素參與胃癌的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SGC7901細(xì)胞中miR-1322表達(dá)后，SGC7901 細(xì)胞凋亡比例增加，細(xì)胞遷移能力明顯減弱，提示miR-1322在胃癌中是一種抑癌因素。

miRNA 主要通過(guò)以序列不完全或完全互補(bǔ)與靶基因mRNA3’非翻譯區(qū)相互結(jié)合，促進(jìn)靶基因mRNA 的分解，阻滯靶基因 mRNA 的翻譯［12-13］。為了探究 miR-1322 在胃癌中的作用機(jī)制，本研究用PicTar 軟件預(yù)測(cè)miR-1322 的靶基因，TRPV4可能是miR-1322的靶基因。TRPV4蛋白是一種通道蛋白，包括 871 個(gè)氨基酸［14］。TRPV4 蛋白在多數(shù)腫瘤組織或細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其通過(guò)抑制凋亡蛋白表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時(shí)TRPV4 蛋白可通過(guò)降低細(xì)胞的剛度促進(jìn)細(xì)胞的遷移［15-16］。TRPV4 蛋白在胃癌組織中表達(dá)升高，參與促進(jìn)胃癌的進(jìn)展［17］。qRT-PCR 和Western blot結(jié)果表明，上調(diào)miR-1322的表達(dá)后，TRPV4基因表達(dá)顯著下降，表明TRPV4 mRNA 翻譯過(guò)程被抑制。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-1322組SGC7901細(xì)胞TRPV4蛋白表達(dá)降低后，細(xì)胞凋亡蛋白caspase 3、caspase 8 表達(dá)增加，細(xì)胞遷移蛋白β-catenin 表達(dá)降低。TRPV4 基因表達(dá)改變可能是對(duì)照組和miR-1322組細(xì)胞凋亡和遷移能力差異的關(guān)鍵。

綜上所述，上調(diào)miR-1322 可促進(jìn)胃癌SGC7901 細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的遷移能力，其機(jī)制可能與TRPV4基因表達(dá)改變有關(guān)。miR-1322 對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展有抑制作用，可能成為胃癌治療的分子靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突。