賴玲林 李素娟 胡楚璇 陳燕 陳力 何娟 盧慧勤

1廣東省第二人民醫(yī)院臨床研究部，廣州 510317；2廣東省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510317

骨質(zhì)疏松癥是以低骨密度及骨組織微構(gòu)造退變?yōu)樘匦缘囊环N全身性代謝骨病，伴有骨脆性增加，容易發(fā)生骨折，是當(dāng)前世界上絕經(jīng)后婦女、中老年人中發(fā)病率、病死率及保健費(fèi)用損耗較大的疾病之一［1］。同時(shí)骨質(zhì)疏松對(duì)許多疾病的發(fā)病率和病死率影響巨大，隨著社會(huì)老年化的進(jìn)程，重視骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展是臨床的研究熱點(diǎn)。骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制主要是機(jī)體破骨細(xì)胞功能得到加強(qiáng)，作為骨組織成分的一種，破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致骨形成及骨吸收失偶聯(lián)，使骨質(zhì)量降低與骨量減少，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生［2］?，F(xiàn)有的治療藥物雙磷酸鹽、雌激素及其受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素等由于其不可避免的不良反應(yīng)，使用風(fēng)險(xiǎn)很大［3］。因此尋找新的治療方案成為了骨質(zhì)疏松臨床治療的研究熱點(diǎn)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相 關(guān) 調(diào) 節(jié) 蛋 白（regulatory associated protein of mTOR，Raptor）是絲氨酸/蘇氨酸激酶功能性復(fù)合物mTORC1的重要組分，在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、自噬和氨基酸攝取中都能發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。近期一項(xiàng)研究表明，mTORC1能夠刺激Paget病患者的破骨細(xì)胞形成［5］，但Raptor 是否在其中發(fā)揮作用尚未得知。于2020 年1 月至2021 年6 月本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)來(lái)探討Raptor 對(duì)小鼠髓系細(xì)胞破骨分化與骨吸收的影響及其作用機(jī)制，以期為臨床治療骨質(zhì)疏松提供新的思路與證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 髓系細(xì)胞提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海晶抗生物工程有限公司；SYBR Green 染料購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司；PCR 引物由中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司合成；破骨分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子（spi-1 proto-oncogene，PU.1）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、Fos 蛋白（c-Fos）以及β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司；ELISA 試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性6～8 周齡清潔級(jí)B6/C57 小鼠10 只購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部［生產(chǎn)許可證為SCXK（京）2018-0010］，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料與飲用水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度保持在（25±2）℃，相對(duì)濕度保持在（40±2）%。對(duì)動(dòng)物房進(jìn)行定期消毒和通風(fēng)，總共進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。敲除組通過(guò)基因敲除構(gòu)建髓系細(xì)胞特異性敲除Raptor小鼠模型。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 兩組小鼠正常飼養(yǎng)14 d 后處死，并收集血清以及通過(guò)試劑盒分離髓系細(xì)胞，在含有10%小牛血清的培養(yǎng)皿中培育一段時(shí)間后通過(guò)100 μg/L 的sRANKL誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞。

1.3.2 免疫印跡試驗(yàn)（Western blot） 將收集到的處理后細(xì)胞懸液在離心半徑10 cm 的條件下，以1 200 r/min離心5 min 后，棄去上清液，然后加入RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制劑提取總蛋白，提取出的蛋白放入10 ml EP 管中，然后向其中加入5 倍體積的十二烷基磺酸鈉，混勻后放入95～100 ℃沸水中水煮變性，冷卻后放入-20 ℃?zhèn)溆?。每次向?zhǔn)備好的電泳配件中加入10 μl 蛋白，設(shè)置電泳條件為80 V 恒壓，30 min，結(jié)束后改變電泳條件為120 V 恒壓，50～60 min。當(dāng)所需的蛋白分子量所在區(qū)域有一定分離度時(shí)可提前停止電泳。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)模，條件為200 mA 恒流，按分子量確定時(shí)間。轉(zhuǎn)膜后分別孵育破骨分化相關(guān)基因PU.1、CTSK、c-Fos 抗體與相對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后將含有蛋白標(biāo)記的膜洗凈，涂上化學(xué)發(fā)光顯影液通過(guò)顯影儀拍照，對(duì)結(jié)果用ImageJ 軟件對(duì)灰度值進(jìn)行系統(tǒng)性分析。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 將將收集到的處理后細(xì)胞懸液在離心半徑10 cm的條件下，以1 200 r/min離心5 min 后，棄去上清液，向沉淀中加入適量TRIzol 試劑，在冰上孵育5～10 min后加入預(yù)冷過(guò)的氯仿0.2 ml。繼續(xù)冰上孵育5 min 后1 200 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移水相，加入等體積異丙醇后再次離心10 min，棄上清液。加預(yù)冷75%乙醇溶液洗滌，棄上清后風(fēng)干，加入40～200 μl的無(wú)酶水溶解制得RNA 備用。通過(guò)制備的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后加入SYBR Green 染料與正反向引物混合離心（引物序列見(jiàn)表1），隨后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號(hào)值（Ct 值）進(jìn)行相對(duì)定量分析，比較2 組細(xì)胞中JAK3的mRNA 表達(dá)水平。

表1 破骨分化相關(guān)基因引物序列

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 取出部分小鼠血清，在離心半徑10 cm 的條件下，以1 200 r/min離心5 min后轉(zhuǎn)移上清液至干凈的EP 管，按照ELISA 試劑盒步驟對(duì)樣本骨吸收代謝產(chǎn)物I 型膠原C 端肽（C-telopeptide of type I，CTXI）、I 型膠原 N 端肽（N-telopeptide of type I，NTX1）及尿羥脯氨酸（U-Hydroxyproline，U-HYP）進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的吸光度，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算其中U-CTXI與U-NTXI含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有結(jié)果取得數(shù)據(jù)都是基于3次及以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，且計(jì)量資料符合正態(tài)分布，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析所使用的軟件為SPSS 22.0 版本，當(dāng)P＜0.05 時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測(cè)2組細(xì)胞PU.1、CTSK、c-Fos的蛋白表達(dá)情況 采用Western blot技術(shù)檢測(cè)2組破骨分化相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的變化，結(jié)果如圖1 所示，與對(duì)照組相比，敲除Raptor 后敲除組小鼠髓系細(xì)胞中破骨分化相關(guān)基因PU.1、CTSK、TRAP 的蛋白表達(dá)量顯著降低（均P＜0.05）。

圖1 2 組小鼠細(xì)胞中破骨分化相關(guān)基因的蛋白水平（重復(fù)3次）

2.2 RT-PCR 檢測(cè) 2 組細(xì)胞中 PU.1、的 mRNA 表達(dá)情況 采用RT-PCR 技術(shù)敲除破骨分化相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的變化，結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，敲除Raptor后敲除組小鼠髓系細(xì)胞中破骨分化相關(guān)基因PU.1、CTSK、TRAP 的mRNA 表達(dá)量顯著降低，與蛋白趨勢(shì)較為一致（均P＜0.05）。

圖2 2組小鼠細(xì)胞中PU.1、CTSK、c-Fos的mRNA水平（重復(fù)3次）

2.3 ELISA 檢測(cè)2 組細(xì)胞中骨吸收指標(biāo)的表達(dá)情況ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Raptor 敲除小鼠血清CTXI、NTX1及U-HYP表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具體見(jiàn)表2。

表2 2組小鼠細(xì)胞中骨吸收代指標(biāo)CTXI、NTX1及U-HYP的表達(dá)情況（）

表2 2組小鼠細(xì)胞中骨吸收代指標(biāo)CTXI、NTX1及U-HYP的表達(dá)情況（）

注：敲除組為通過(guò)基因敲除構(gòu)建髓系細(xì)胞特異性敲除Raptor小鼠模型，對(duì)照組為正常B6/C57 小鼠；CTXI 為I 型膠原C 端肽，NTX1為I型膠原N端肽，U-HYP為尿羥脯氨酸

U-HYP（μg/L）20.51±2.85 14.49±1.84 3.968 0.004組別對(duì)照組敲除組t值P值n 5 5 CTXI（pg/ml）185.53±36.69 124.58±25.77 3.040 0.016 NTX1（μg/L）2.89±0.37 2.21±0.42 2.717 0.026

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥一直是臨床治療的難點(diǎn)問(wèn)題，其發(fā)病機(jī)制主要與破骨細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。破骨細(xì)胞是一類來(lái)源于髓系前體細(xì)胞，其分化主要經(jīng)歷了幾個(gè)重要的分化階段：造血干細(xì)胞分化成髓系前體；髓系前體形成破骨細(xì)胞前體；破骨細(xì)胞前體再分化形成單個(gè)核的破骨細(xì)胞；多個(gè)單個(gè)核的破骨細(xì)胞融合形成多個(gè)核的成熟的破骨細(xì)胞［6］。在健康人體內(nèi)其骨組織中具有骨吸收功能的破骨細(xì)胞與具有骨形成功能的成骨細(xì)胞保持著平衡，一旦出現(xiàn)紊亂則會(huì)造成不良影響，如破骨細(xì)胞分化水平增加會(huì)導(dǎo)致骨吸收功能增強(qiáng)，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生［7］。目前臨床治療藥物均有較大的風(fēng)險(xiǎn)與不良反應(yīng)，近年來(lái)靶向治療已成為臨床研究的熱點(diǎn)，以抑制破骨細(xì)胞分化形成和骨吸收功能為靶點(diǎn)已經(jīng)成為目前治療破骨細(xì)胞相關(guān)骨代謝疾病的主要策略。

破骨細(xì)胞是在骨組織的微環(huán)境下產(chǎn)生的，為了在體外獲得穩(wěn)定的破骨細(xì)胞，我們通過(guò)給予破骨細(xì)胞分化因子RANKL 誘導(dǎo)前體細(xì)胞破骨分化［8］。Raptor 作為 mTOR 調(diào)節(jié)蛋白，能夠與mTOR 形成關(guān)鍵復(fù)合物mTORC1，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在本研究中，我們通過(guò)敲除小鼠Raptor 基因取得樣本并進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。PU.1、CTSK、c-Fos 是參與破骨細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵基因，其中PU.1 主要參與調(diào)控破骨細(xì)胞早期分化［9］，介導(dǎo)了前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞前體分化的形成和存活；CTSK 能夠阻止多個(gè)單核破骨細(xì)胞融合成成熟的破骨細(xì)胞；c-Fos是JNK和ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的重要參與者，參與了調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞相關(guān)的特異性蛋白的表達(dá)，能夠通過(guò)促使單核細(xì)胞更多地向巨噬細(xì)胞分化來(lái)阻滯破骨細(xì)胞定向分化［10］。在本研究中，Western blot 與 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2 組細(xì)胞中成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因PU.1、CTSK、c-Fos 的蛋白及mRNA 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，敲除Raptor基因后細(xì)胞PU.1、CTSK、c-Fos 的蛋白及mRNA 較對(duì)照組顯著降低，提示Raptor基因與破骨細(xì)胞的分化具有緊密聯(lián)系，Raptor在前體細(xì)胞分化成成熟的破骨細(xì)胞全過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CTXI、NTX1及U-HYP在之前的研究中與骨密度呈負(fù)相關(guān)，能夠直觀地體現(xiàn)骨吸收情況［11］，在多項(xiàng)研究中骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)CTXI、NTX1 及U-HYP 水平均顯著高于健康對(duì)象者。在本研究中，ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除組血清CTXI、NTX1 及U-HYP 水平較對(duì)照組顯著降低，提示敲除Raptor基因其骨吸收功能受到了明顯抑制，這可能與敲除Raptor抑制了破骨細(xì)胞分化進(jìn)程，從而降低了骨吸收功能有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行Raptor 基因敲除，并將提取的前體髓系細(xì)胞通過(guò)RANKL 進(jìn)行誘導(dǎo)破骨分化并與未敲除Raptor 的樣本進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)敲除Raptor 能夠顯著抑制成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因PU.1、CTSK、c-Fos 的蛋白及mRNA 表達(dá)水平，降低骨吸收指標(biāo)CTXI、NTX1 及U-HYP 的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞分化的進(jìn)程。本研究為臨床治療骨質(zhì)疏松癥及其他破骨細(xì)胞相關(guān)骨代謝疾病提供了新的思路與研究證據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突。