操雪 楚天舒

河南省人民醫(yī)院 鄭州大學人民醫(yī)院河南大學人民醫(yī)院風濕免疫科，鄭州 450003

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率約為0.5%～1.0%，它以反復發(fā)作的滑膜炎及血管翳的形成為病理基礎(chǔ)，臨床主要表現(xiàn)為對稱性多關(guān)節(jié)滑膜炎，從而造成關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞，可引起明顯的關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、活動受限，最終導致關(guān)節(jié)畸形，此外，還多伴有關(guān)節(jié)外系統(tǒng)性損害，嚴重危害患者的健康和生活質(zhì)量［1-3］。但現(xiàn)如今，由于RA 發(fā)病的復雜性，病因及機制仍未完全闡明，臨床上缺乏根治本病的有效措施，一般資料相似的RA患者，療效異質(zhì)性仍較明顯。因此深入研究RA 發(fā)病機制，對改進治療策略提供參考意義重大［4］。近年來，遺傳因素在RA易感性、病情活動度方面受到重視，如針對高表達的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α）的靶向治療已比較成熟，但部分患者療效欠佳，因此推測個體基因可能參與了RA 的發(fā)?。?］。許多全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）已經(jīng)證實單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與自身免疫性疾病相關(guān)，其中，非人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）的序列相似性家族167A-B 淋巴酪氨酸激酶（family with sequence similarity 167A-B lymphoid tyrosine kinase，F(xiàn)AM167A-BLK）基因多態(tài)性已證實與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，但是否與RA 有關(guān)尚未得到廣泛研究［6］。因此，本研究旨在探索FAM167A-BLK基因多態(tài)性與RA病情活動的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為單中心前瞻性隊列研究。選取2019年9月至2020年9月河南省人民醫(yī)院住院部收治的 309 例 RA 患者。（1）入院標準：均符合 1987 年或 2010 年美國風濕病學會（ACR）的 RA 分類標準［7］。（2）排除標準：①肝、腎功能嚴重受損患者；②直系親屬或本人合并有其它自身免疫性疾病病史；③近1 月內(nèi)有感染者；④配合度較差者。根據(jù)疾病活動度分為低活動組162 例，男87 例，女75 例，年齡范圍為28～65 歲，年齡（45.24±8.33）歲；高活動組 147 例，男 70 例，女 77 例，年齡范圍為 30～68 歲，年齡（44.96±7.01）歲。所有參與者均對本研究知情，自愿簽署知情同意書。

本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會審批通過（2019-41）。

1.2 方法

1.2.1 RA 活動度評估 根據(jù)類風濕關(guān)節(jié)炎疾病活動評分（disease activity score 28，DAS28）［8］，以28 個關(guān)節(jié)記分：包括雙手掌指關(guān)節(jié)、雙手近端指間關(guān)節(jié)、雙肩關(guān)節(jié)、雙肘關(guān)節(jié)、雙腕關(guān)節(jié)和雙膝關(guān)節(jié)，并根據(jù)以下公式計算：DAS28（CRP）=0.56 ×sqrt（TJC28）+0.28 ×sqrt（SJC28）+0.36×Ln（CRP +1）+0.014 ×GH +0.96。低活動組：DAS28 評分＜3.2分，高活動度組：DAS28評分≥3.2分。

1.2.2 標本采集與檢測 EDTA 抗凝管采集患者外周血4 ml，根據(jù)DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）說明書提取 DNA。 在Hapmap 數(shù)據(jù)庫查詢FAMl67A-BLK 的各SNP 位點位置，選取最小等位基因頻率≥5%SNP位點進行研究。通過MALDI-TOF MS 系統(tǒng)對所選 FAMl67A-BLK 的 4 個 SNP 位點（rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546）進行基因分型。先通過PCR 擴增出目標序列，特異性引物序列及PCR 反應體系如表1～2 所示。隨后加入SNP序列特異性延伸引物（表3），制備的樣本分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后將結(jié)晶體放入質(zhì)譜儀真空管中，瞬時強激光激發(fā)，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被分離檢測。 最后，應用軟件MassARRAY RT 及MassARRAY Typer完成基因分析。

表1 引物序列

表3 單堿基延伸反應體系

1.3 觀察指標 （1）比較兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、民族、戶口所在地、合并疾病。（2）分析基因分型質(zhì)量與Hard-Wemberg 平衡檢驗結(jié)果。（3）比較兩組各SNP位點基因型。（4）比較兩組等位基因分布情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料進行正態(tài)分布，行Kolmogorov-Smirnov 檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，行t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)表示，行Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料用例（%）表示，行χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 兩組患者的年齡、性別、BMI、民族、戶口所在地、合并疾病比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），均衡可比，具體見表4。

表4 兩組類風濕關(guān)節(jié)炎患者一般資料比較[例（%）]

2.2 基因分型質(zhì)量與Hard-Wemberg 平衡檢驗FAMl67A-BLK 的 SNP 位 點 rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 分型成功率＞90%，實驗中為檢測基因分型質(zhì)量的可重復性，設置的30 份重復樣本分型結(jié)果吻合率為100%，提示基因分型結(jié)果可靠。rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 均符合 Hard-Wemberg 平衡檢驗定律（P=0.512、0.334、0.718、1.000），表明入組者代表性良好。

表2 PCR反應體系液

2.3 兩組各SNP 位點基因型 兩組FAMl67A-BLK 的SNP 位點 rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 基因型比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），具體見表5。

表5 兩組類風濕關(guān)節(jié)炎患者各SNP位點基因型比較[例（%）]

2.4 兩組等位基因攜帶者與頻率分布 高活動組FAMl67A-BLK rs13277113位點G等位基因、rs7812879位點T等位基因、rs2736340位點C等位基因、rs2254546位點A等位基因攜帶者均低于低活動組（均P＜0.05），具體見表6。FAMl67A-BLK 各SNP 位點等位基因頻率分布呈現(xiàn)出相似規(guī)律（均P＜0.05），具體見表7。

表6 兩組類風濕關(guān)節(jié)炎患者等位基因攜帶者分布比較[例（%）]

表7 兩組類風濕關(guān)節(jié)炎患者等位基因頻率比較（%）]

3 討 論

RA 是一種慢性殘毀性關(guān)節(jié)炎，具有致畸性、致殘性，而控制疾病活動度，促進病情緩解是改善患者預后的重要策略，因此從基因角度闡明影響RA 活動度的因素，有助于發(fā)現(xiàn)影響RA病情活動的原因，對病情轉(zhuǎn)歸具有積極意義［9-10］。

FAMl67A-BLK 基因 區(qū)域位于染 色體 8p23.22 上［11］。Song 等［12］報 道 顯 示 ，F(xiàn)AMl67A-BLK 的 SNP 位 點rs13277113、rs2736340 與橋本氏甲狀腺炎有關(guān)。Chen 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM167A-BLK基因中多態(tài)性與漢族人群的多肌炎/皮肌炎有關(guān)。均提示FAMl67A-BLK 基因多態(tài)性與自身免疫疾病有關(guān)，但在RA 中的報道較少。本研究顯示，不同病情活動度患者FAMl67A-BLK 的SNP 位點rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 基因型比較差異顯著，表明FAMl67A-BLK基因多態(tài)性與RA病情活動有關(guān)。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，RA 高活動患者FAMl67A-BLK rs13277113 位點G等位基因、rs7812879位點T等位基因、rs2736340位點C等位基因、rs2254546 位點A 等位基因攜帶者均低于低活動患者，對應的等位基因頻率亦低于低活動患者，提示rs13277113 位點 G 等位基因、rs7812879 位點 T 等位基因、rs2736340 位點 C 等位基因、rs2254546 位點 A 等位基因與RA病情活動相關(guān)。

BLK 基因編碼產(chǎn)物主要表達于B 細胞，是src 酪氨酸激酶家族成員之一，能通過B 細胞信號通路被激活，并在信號級聯(lián)放大作用下，激活下游核轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控B 細胞生長、發(fā)育［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)，當 B 淋巴細胞表達的 BLK 突變活躍時，可促進前B 淋巴細胞的增生，增強其對白介素的反應性［16］。而白介素-6、白介素-4 等已被證實在 RA 中異常表達，可引導已經(jīng)激活的B 細胞分化成熟，轉(zhuǎn)化為免疫球蛋白分泌活性的漿細胞，并能調(diào)控T 調(diào)節(jié)細胞的分化，構(gòu)成促炎性環(huán)境，從而增加RA 活動度，加重RA 病情。且當BLK 基因調(diào)控BLK 蛋白表達時，會影響B(tài) 細胞的耐受機制，打破Th17/Treg 間的平衡，介導過度免疫，使機體易產(chǎn)生自體免疫，從而影響 RA 病情活動情況［17］。FAMl67A 基因的功能現(xiàn)階段尚不清晰，根據(jù) Mentlein 等［18］研究，F(xiàn)AMl67A 可通過編碼無序自身免疫蛋白，介導自身過度免疫，從而導致RA。本研究不足支持在于，納入病例數(shù)較少，且FAMl67A-BLK的SNP位點在分子水平如何影響RA活動度仍未明確，有待進一步基因功能的研究去探索。

綜 上 所 述 ，F(xiàn)AMl67A-BLK 的 SNP 位 點 rs13277113、rs7812879、rs2736340、rs2254546 基因型在不同 RA 病情活動患者中存在顯著差異，F(xiàn)AMl67A-BLK rs13277113 位點G等位基因、rs7812879位點T等位基因、rs2736340位點C等位基因、rs2254546位點A等位基因與RA病情活動密切相關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。