★ 黎艷剛 李麗云 丁江生 羅小泉 楊武亮（.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省藥物研究所/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650；．江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

阿奇霉素為第二代大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，主要用于治療呼吸道及生殖道感染?？芍委煻喾N病原體引起的兒童及成人的呼吸道感染，生殖道沙眼衣原體感染等，并被多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的醫(yī)學(xué)指南推薦作為上述感染的一線治療藥物［1-3］。原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）2016年5月26號(hào)發(fā)布了《總局關(guān)于落實(shí)《國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于開(kāi)展仿制藥質(zhì)量與療效一致性評(píng)價(jià)的意見(jiàn)》有關(guān)事項(xiàng)公告（2016年第106號(hào)）》，其中確規(guī)定阿奇霉素膠囊應(yīng)在2018年底完成一致性評(píng)價(jià)。CFDA在2016年8月17號(hào)發(fā)布了《關(guān)于2018年底前須仿制藥質(zhì)量與療效完成一致性評(píng)價(jià)品種批準(zhǔn)文號(hào)信息》中阿奇霉素膠囊數(shù)量共有41個(gè)，品種規(guī)格為0.25 g（25萬(wàn)單位）。CFDA在2017年4月28號(hào)發(fā)布了《總局關(guān)于發(fā)布仿制藥參比制劑目錄（第三批）的通告（2017年第65號(hào)）》中將原研進(jìn)口普利瓦制藥公司生產(chǎn)的阿奇霉素膠囊作為參比制劑。此次一致性評(píng)價(jià)工作不僅要療效一致，還要質(zhì)量一致，本文通過(guò)對(duì)中國(guó)藥典［4］、歐洲藥典、進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)［5］所收載的阿奇霉素膠囊的含量測(cè)定方法進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)中國(guó)藥典方法出峰時(shí)間長(zhǎng)，歐洲藥典方法和進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法一致，出峰時(shí)間適中，重現(xiàn)性好，選擇進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并對(duì)參比制劑進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器和試藥

Waters e2695 高效液相色譜儀，賽多利斯 CPA 225D電子天平，梅特勒 DELTA 320型pH計(jì)。阿奇霉素膠囊，克羅地亞普利瓦制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)為106066、950056、951056；阿奇霉素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為130593-201303，純度為94.4 %；乙腈為色譜純，水為純化水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件采用Shodex Asahipak ODP-50 4D色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鉀6.7 g，加水1 000 mL使溶解，混勻）-乙腈（40∶60），用10 mol/L氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至（11.0±0.1）為流動(dòng)相。流速為1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 稀釋劑A以磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鉀6.7 g，加水1 000 mL使溶解，混勻）-乙腈（40∶60），用磷酸調(diào)節(jié)pH值至8.0。

2.2.2 對(duì)照品溶液取阿奇霉素對(duì)照品約25 mg，精密稱(chēng)定，至50 mL容量瓶中，加乙腈2 mL，充分振搖使溶解，再加入稀釋劑A稀釋至刻度線，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液精密稱(chēng)取阿奇霉素膠囊內(nèi)容物適量（相當(dāng)于阿奇霉素50 mg），置100 mL量瓶中，加乙腈2 mL，充分振搖使溶解，再加稀釋劑A稀釋至刻度線，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.4 空白輔料溶液取空白輔料適量（約相當(dāng)于阿奇霉素50 mg），置100 mL量瓶中，加乙腈2 mL，再加稀釋劑A稀釋至刻度線，充分振搖使溶解，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液取阿奇霉素和阿奇霉素雜質(zhì)A對(duì)照品各約5 mg，置10 mL容量瓶中，加乙腈0.5 mL，充分振搖使溶解，再加入稀釋劑A稀釋至刻度線。搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)精密量取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白輔料溶液及系統(tǒng)適用性溶液各10 μL。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1-4。測(cè)定結(jié)果表明空白輔料不干擾本品含量的測(cè)定，雜質(zhì)A與阿奇霉素分離度大于2 %，方法的專(zhuān)屬性良好。

圖1 專(zhuān)屬性圖譜

2.4 線性關(guān)系考察精密稱(chēng)取阿奇霉素對(duì)照品約25 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈2 mL，充分振搖使溶解，再加入稀釋劑A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用稀釋劑A稀釋制成不同濃度的對(duì)照品溶液，精密量取上述各對(duì)照品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品的濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)r。見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度

2.5.1 儀器精密度精密量取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以主峰峰面積的RSD為指標(biāo)考察儀器精密度。結(jié)果對(duì)照品溶液主峰峰面積的RSD值為0.13%，說(shuō)明該方法的儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性取阿奇霉素膠囊內(nèi)容物適量6份，每份約65 mg，按“2.2.3”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液；按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果阿奇霉素的平均含量100.95，RSD為0.39 %；表明重復(fù)性良好。

2.5.3 中間精密度取阿奇霉素膠囊內(nèi)容物適量12份，每份約65 mg，按“2.2.3”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液；按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，其中第一天的數(shù)據(jù)為引用重復(fù)性項(xiàng)下的結(jié)果，第二天的數(shù)據(jù)由不同的人、不同的儀器完成，結(jié)果12份阿奇霉素樣品的平均含量99.88，RSD為0.61 %，表明本法中間精密度好。

2.6 溶液穩(wěn)定性取供試品溶液于室溫條件下放置0、4、8、12、16、20、24 h，精密量取上述樣品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，考察峰面積的變化情況。供試品溶液中主峰峰面積的RSD為0.88 %，結(jié)果表明供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 準(zhǔn)確度精密稱(chēng)取阿奇霉素對(duì)照品約50 mg，置25 mL量瓶中，加入乙腈2 mL，充分振搖使溶解，再加入稀釋劑A稀釋至刻度，搖勻，作為阿奇霉素對(duì)照品貯備液。取空白輔料約150 mg，置1 000 mL量瓶中，加稀釋劑A至刻度，搖勻，作為空白輔料溶液。取9個(gè)10 mL容量瓶，分成低、中、高濃度3組（80 %、100 %、120 %），每組各3份，低濃度組每份各加貯備液2 mL、中濃度組每份各加貯備液2.5 mL、高濃度組每份各加貯備液3 mL；再依次加空白輔料溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為80 %、100 %、120 %的供試品溶液。另精密稱(chēng)取阿奇霉素對(duì)照品約25 mg置50 mL容量瓶中，加入乙腈2 mL，充分振搖使溶解，再加入稀釋劑A稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每份供試品的含量，并計(jì)算3種不同濃度溶液的回收率。結(jié)果表明，本品9份樣品的平均回收率為99.85 %，RSD值為0.84 %，該測(cè)定方法回收率良好。見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn)通過(guò)改變流動(dòng)相比例、流速、柱溫、不同批號(hào)不同廠家的色譜柱對(duì)擬定的色譜條件進(jìn)行耐用性考察。精密量取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明當(dāng)柱溫變動(dòng)±5 ℃、流速變動(dòng)±10 %、流動(dòng)相的比例變動(dòng)±2 %、改變色譜柱時(shí)，含量結(jié)果均符合規(guī)定，說(shuō)明本法對(duì)柱溫、流速、流動(dòng)相的比例、色譜柱的耐用性良好。

2.9 樣品含量測(cè)定分別取上述三批阿奇霉素膠囊內(nèi)容物約65 mg，精密稱(chēng)定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量。見(jiàn)表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果 %

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)中國(guó)藥典、歐洲藥典及進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中阿奇霉素的出峰時(shí)間適中，對(duì)稱(chēng)因子、分離度、柱效均符合要求，最后選擇了進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的方法作為本品含量測(cè)定方法。本文還考察了不同溶劑對(duì)供試品溶液的影響，結(jié)果顯示，乙腈/稀釋劑A作為供試品的處理方法效果較好。