邸泰霖， 紀(jì)云兆， 蔣文靜， 孔 磊， 王子斌， 劉大鵬

結(jié)腸癌是40～50歲男性高發(fā)的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，本病病因與患者飲食習(xí)慣、結(jié)腸慢性炎癥、結(jié)腸息肉及家族史等有關(guān)[1]。近些年的研究顯示，癌基因激活及抑癌激活失活也是本病的重要影響因素[2]。P2X亞單位受體（P2X7）是嘌呤家族受體的一種，具有細(xì)胞外核苷酸結(jié)合能力，并以此向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、增殖，同時(shí)影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程[3]。P2X7受體還可抑制糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）表達(dá)，進(jìn)而阻滯Wnt/β-catenin經(jīng)典信號路徑活化，而Wnt/β-catenin信號路徑是結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要誘因，與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。本研究通過研究結(jié)腸癌患者的癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本中的P2X7受體表達(dá)情況，探討P2X7受體表達(dá)與結(jié)腸癌腫瘤特征及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2018年1月在河北中石油中心醫(yī)院手術(shù)治療的120例結(jié)腸癌患者，其中男65例，女55例；年齡47～75歲，平均（63.5±7.6）歲；病灶部位：左半結(jié)腸77例、右半結(jié)腸43例；病灶直徑：≥ 5 cm 65例、<5 cm 55例；腫瘤分化程度：高分化26例、中分化45例、低分化49例；TNM分期：Ⅰ期13例、Ⅱ期34例、Ⅲ期73例；切緣陽性26例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性70例。本研究方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)后實(shí)施。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)腸癌患者，結(jié)腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2020年版）》[5]中的標(biāo)準(zhǔn)；2）年齡18～75歲；3）術(shù)前患者未接受放療、化療、免疫學(xué)治療；4）具有完整的隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）病理學(xué)資料缺失；2）轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者。

1.2 方法 采用免疫組化染色檢測P2X7受體的陽性表達(dá)率：將兩組樣本進(jìn)行包埋、切片后，采用烘箱對切片進(jìn)行烘烤，溫度設(shè)置為62 ℃，時(shí)長為1～2 h。隨后進(jìn)行脫蠟及水化操作，并選用0.01 mol/L檸檬鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)操作，滴入2 mL 3% H2O2抑制樣本酶活性，DAB染色蘇木精復(fù)染，流水沖洗2次，鹽酸乙醇分化2 s，流水沖洗10 min，梯度乙醇洗脫，透明并封片，鏡下觀察結(jié)果（XSP7B，雙目生物顯微鏡，上海萬衡精密儀器有限公司）。評分標(biāo)準(zhǔn)[6]：根據(jù)病理切片中陽性細(xì)胞的百分比和著色的強(qiáng)度，由2位病理科醫(yī)生進(jìn)行半定量免疫組織化學(xué)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細(xì)胞的百分比≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。著色強(qiáng)度：0分為不著色；1分淺黃色；2分黃色；3分棕褐色。取上述兩項(xiàng)分值的乘積作為總積分：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），6～8分為陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。其中（+）及以下為低表達(dá)，（++）及以上為高表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo) 記錄患者年齡、性別、腫瘤部位等一般資料，隨訪記錄患者預(yù)后及生存期，分析不同預(yù)后患者的病理學(xué)特征差異，同時(shí)分析P2X7受體與患者3年預(yù)后結(jié)局的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；P2X7受體表達(dá)與患者生存的關(guān)系采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，多因素分析采用Logistic回歸分析法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本中P2X7受體表達(dá)水平比較 結(jié)腸癌組織中P2X7受體高表達(dá)率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1、圖1。

表1 兩組標(biāo)本中P2X7受體表達(dá)水平比較

圖1 免疫組化結(jié)果（SP，×200）

2.2 P2X7受體不同表達(dá)患者的3年生存情況比較 隨訪3年，P2X7受體低表達(dá)組患者的死亡率高于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表2）。生存分析結(jié)果顯示，P2X7受體低表達(dá)組患者的生存時(shí)間長于高表達(dá)組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log Rank χ2=4.652，P=0.031，圖2）。

表2 不同P2X7受體表達(dá)患者的3年隨訪情況比較

圖2 P2X7低表達(dá)組與高表達(dá)組的生存曲線

2.3 單因素分析結(jié)果 存活組與死亡組患者的腫瘤分化程度、TNM分期、切緣陽性率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、脈管浸潤情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組年齡、性別、腫瘤部位、病灶直徑、術(shù)后化療情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 單因素分析結(jié)果[n（%）]

2.4 多因素分析 以患者3年隨訪結(jié)局為因變量（生存=0、死亡=1），以腫瘤分化程度（高+中分化=0、低分化=1）、TNM分期（Ⅰ+Ⅱ期=0、Ⅲ期=1）、切緣陽性（否=0、是=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（否=0、是=1）、脈管浸潤（否=0、是=1）、P2X7受體（低表達(dá)=0、高表達(dá)=1）作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：TNM分期高、切緣陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、脈管浸潤、P2X7受體低表達(dá)是結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），見表4。

表4 Logistic回歸分析結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的影響因素

3 討論

P2X7受體是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)之一，葡聚糖硫酸造模的結(jié)腸炎小鼠病灶組織內(nèi)存在P2X7受體高表達(dá)情況，結(jié)腸炎誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤病灶內(nèi)也可見P2X7受體高表達(dá)情況[7]。但近年研究顯示，P2X7受體雖然具有促急性腸炎發(fā)生的發(fā)展的能力，但也可抑制結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌進(jìn)展[8-9]。動物實(shí)驗(yàn)顯示，對炎癥性疼痛大鼠加以干預(yù)，通過使P2X7受體表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中P2X7受體高表達(dá)率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以發(fā)現(xiàn)P2X7受體低表達(dá)與結(jié)腸癌病理變化密切相關(guān)。P2X7受體是腫瘤腺苷三磷酸（ATP）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其介導(dǎo)的P2X7受體及P2X7受體信號路徑對腫瘤細(xì)胞生長、自噬以及存活/凋亡平衡具有重要影響[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體可通過激活NLRP3/IL-1β信號通路，參與了大鼠炎性疼痛的形成[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌黏膜表面可見明顯P2X7受體低表達(dá)，推測P2X7受體低表達(dá)可能是宮頸癌病變的重要危險(xiǎn)因素，同時(shí)也可能是宮頸癌靶向治療的新方向[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨訪3年，P2X7受體低表達(dá)組患者的死亡率為52.6%，高于高表達(dá)組的33.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，P2X7受體低表達(dá)組患者的生存時(shí)間短于高表達(dá)組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明P2X7受體表達(dá)水平還與結(jié)腸癌患者預(yù)后密切相關(guān)，P2X7受體檢測可能是結(jié)腸癌患者預(yù)后評估的重要方法。分析P2X7受體抑制結(jié)腸癌進(jìn)展，改善患者預(yù)后的機(jī)制可能為：1）P2X7受體活化可直接阻滯腫瘤細(xì)胞生長、分裂[14]；2）P2X7受體可誘導(dǎo)腸道IL-1β表達(dá)，并促使信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）活化，提示P2X7受體可增強(qiáng)腸道細(xì)胞免疫功能，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞活性[15]；3）P2X7受體活化后將生成非選擇性陽離子通道，并誘使Ca2+及Na+內(nèi)流，K+外流，這將介導(dǎo)多種信號路徑：Na+內(nèi)流，K+外流將激活A(yù)SPK/JNK路徑，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Ca2+內(nèi)流將誘導(dǎo)磷脂酶D表達(dá)，并促使溶酶體與吞噬小體結(jié)合，進(jìn)而對細(xì)胞內(nèi)病原體形成滅殺；Ca2+內(nèi)流還可誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶p38及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶1/2（ERK1/2）表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)下游COX-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）炎性蛋白基因表達(dá)，同時(shí)參與炎癥反應(yīng)[16]。iNOS在腫瘤中的效應(yīng)不一，而P2X7受體可通過調(diào)節(jié)iNOS表達(dá)來抑制結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌。K+外流則可誘導(dǎo)炎性小體3表達(dá)，并活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1），進(jìn)而誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及白細(xì)胞介素 -18（IL-18）合成[17]；4）P2X7受體可抑制TGF-β1表達(dá)，而后者具有促上皮細(xì)胞增殖、抑制腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性等功能；5）Wnt/β-catenin信號路徑與結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖及瘤變密切相關(guān)。而P2X7受體可對GSK-3β生成抑制效應(yīng)，進(jìn)入阻滯Wnt/β-catenin信號路徑活化，抑制結(jié)腸腫瘤生長、增殖[18]。Logistic回歸分析結(jié)果顯示：TNM分期越高、切緣陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、脈管浸潤、P2X7受體低表達(dá)是結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床可通過檢測這些指標(biāo)來分析結(jié)腸癌患者的預(yù)后。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中的P2X7受體呈低表達(dá)，并且是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，臨床或可通過監(jiān)測患者P2X7受體水平來評估患者的預(yù)后。