楊冬梅,霍艷杰,陳臨江,曾 陽(yáng),袁志鷹,庹勤慧,趙洪慶

(湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙410208)

由2019新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCo V)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)在全球范圍內(nèi)流行,嚴(yán)重威脅人們身體健康[1]。新型冠狀病毒肺炎的臨床分型根據(jù)病情危重程度主要為輕型、普通型、重型與危重型[2]。研究發(fā)現(xiàn),在COVID-19重癥及危重癥患者血漿中中性粒細(xì)胞數(shù)量增加,淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低,而多種促炎因子表達(dá)水平明顯上升[3-5]。其中,危重型患者免疫系統(tǒng)已經(jīng)完全紊亂,因炎性因子大量產(chǎn)生而出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴[6-7]。而細(xì)胞因子風(fēng)暴發(fā)生迅速,是新型冠狀肺炎重型患者發(fā)展為危重型患者的主要原因。

血必凈注射液作為國(guó)家中藥二類(lèi)新藥,于非典時(shí)期上市,主要應(yīng)用于膿毒血癥、多臟器功能衰竭綜合征、肺心病急性加重期、急性肺損傷與急性呼吸窘迫綜合征、急性胰腺炎等疾病的治療[8-11]。2020年4月12日,經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn),血必凈新增適應(yīng)證:“可用于新型冠狀病毒肺炎重型、危重型的全身炎癥反應(yīng)綜合征或/和多臟器功能衰竭”[12]。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析血必凈注射液活性成分通過(guò)調(diào)節(jié)免疫與炎癥反應(yīng)治療COVID-19的作用機(jī)制,為其臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫(kù):中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php);Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/);STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/);DisGeNT數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/);DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)。

軟件:可 視 化cytoscape3.5.1軟 件、pymol軟 件 與Autodock4.2分子對(duì)接軟件,易漢博作圖軟件(http://www.ehbio.com/ImageGP/index)。

1.2 藥物活性成分收集與篩選

利用TCMSP收集血必凈注射液:丹參、赤芍、紅花、川芎、當(dāng)歸五味中藥的主要化學(xué)成分。根據(jù)人體對(duì)藥物吸收、分布、代謝及排泄/毒性的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug likeness,DL)≥0.18為篩選條件,初步篩選出血必凈注射液潛在具有較高活性的化合物。

1.3 血必凈注射液作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

基于篩選的活性成分預(yù)測(cè)化合物的作用靶點(diǎn),經(jīng)Drug-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)將化合物分子結(jié)構(gòu)與測(cè)出的靶點(diǎn),經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化為基因簡(jiǎn)稱(chēng)命名。

1.4 篩選血必凈注射液關(guān)鍵活性成分

將血必凈注射液潛在具有較高活性的化合物與成分導(dǎo)入cytoscape 3.5.1軟件進(jìn)行可視化,通過(guò)Network Analyzer功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心性進(jìn)行分析,設(shè)置節(jié)點(diǎn)度(degree)值大于所有節(jié)點(diǎn)連接度2倍中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

1.5 COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建

本研究基于TTD、DisGeNT數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建COVID-19免疫與炎癥相關(guān)靶點(diǎn)。利用在線韋恩圖工具,將COVID-19基因靶點(diǎn)與血必凈注射液活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行映射。

1.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將COVID-19基因靶點(diǎn)與血必凈注射液活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行映射結(jié)果導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)限定物種為Homo sapiens,設(shè)定最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為中度信度0.400得到蛋白相互作用(PPI)相關(guān)信息。導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化,并利用Network analyzer功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?根據(jù)大于平均Degree值對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行篩選分析。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析

篩選出關(guān)鍵作用蛋白導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)定“Background”為“Homo sapiens”,P<0.05,分別導(dǎo)出細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物過(guò)程(BP)進(jìn)行GO分析。根基P<0.05,KEGG富集分析,篩選免疫與炎癥反應(yīng)相關(guān)通路。

1.8 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載SARS-Co V-2 3CL水解酶的3D結(jié)構(gòu)pdb格式文件,移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子,保存為pdb后綴的文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物2D結(jié)構(gòu)的sdf格式文件。利用pymol軟件先上傳去水加氫后的蛋白質(zhì)文件,將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件,采用Auto Dock4.2進(jìn)行分子對(duì)接,選取結(jié)合能<-5 kJ?mol-1且構(gòu)象較好的結(jié)果作為分子對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 血必凈注射液活性成分收集與篩選

血必凈注射液中丹參65個(gè)活性成分、赤芍29個(gè)活性成分、紅花20個(gè)活性成分、川芎7個(gè)活性成分、當(dāng)歸2個(gè)活性成分,剔除重復(fù)數(shù)據(jù),血必凈注射液共有116種活性成分,見(jiàn)表1。

2.2 血必凈注射液活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值“連接度(degree)”成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中,364個(gè)節(jié)點(diǎn),1 687條相互作用關(guān)系(圖1),即選擇degree大于其中位數(shù)值2倍以上的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵候選靶點(diǎn)(degree≥18),得到關(guān)鍵靶點(diǎn)59個(gè)節(jié)點(diǎn),595條相互作用關(guān)系,其中關(guān)鍵成分29個(gè)。以degree排序前10進(jìn)行展示(表2),分別是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、山柰酚、丹參酮IIA、鼠尾草酚酮、4-亞甲丹參新酮、二氫異丹參酮。

2.3 基于抗炎,調(diào)節(jié)免疫作用血必凈注射液治療COVID-19的潛在靶點(diǎn)

基于TTD、DisGeNT數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建COVID-19的免疫與炎癥反應(yīng)靶點(diǎn)541個(gè)。利用在線韋恩圖工具,將COVID-19基因靶點(diǎn)與血必凈注射液活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行映射得到血必凈與COVID-19共同靶點(diǎn)75個(gè)(圖2A)。通過(guò)構(gòu)建成分-炎癥、免疫靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2B),得到159個(gè)節(jié)點(diǎn),1 438條相互作用關(guān)系。經(jīng)degree大于中位數(shù)值2倍進(jìn)行篩選,得到關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)55個(gè),關(guān)鍵活性成分4個(gè),864條相互作用關(guān)系。其中大于平均中介中心性0.014 5的關(guān)鍵靶點(diǎn)9個(gè)(圖2C)。

圖2 活性成分-炎癥、免疫靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集與KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的55個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析及KEGG信號(hào)通路富集(P≤0.05)分析。GO富集分析得到GO生物進(jìn)程(biological process,BP)93個(gè),包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素調(diào)節(jié)信號(hào)通路、血管生成、免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等生物過(guò)程,分子功能(molecular function,MF)17種,細(xì)胞組分(cellular component,CC)11種。根據(jù)P值進(jìn)行排序,選擇前10個(gè)進(jìn)行展示(圖3)。

圖3 GO富集分析

KEGG通路分析得到通路87條,與炎癥免疫相關(guān)27條,包括toll樣受體信號(hào)通路、甲型流感、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、炎癥性腸病(IBD)、NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞因子間受體的相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路(表3、圖4)。

圖4 KEGG通路分析氣泡圖

表3 KEGG通路分析

2.5 核心成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶分子對(duì)接

將“2.2”與“2.3”關(guān)鍵活性化合物與SARS-Co V-2 3CL水解酶對(duì)接,選取結(jié)合能<-5 kJ?mol-1,篩選出12種活性化合物,見(jiàn)表4與圖5。

圖5 部分關(guān)鍵活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶對(duì)接結(jié)果

表4 關(guān)鍵活性化合物對(duì)接結(jié)果

3 討論

COVID-19患者大多表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力和干咳等癥狀,預(yù)后良好。但少數(shù)重型和危重型患者可快速進(jìn)展為膿毒癥休克、出凝血功能障礙及多器官衰竭等,往往預(yù)后不良。而研究發(fā)現(xiàn)SARS-Co V-2感染導(dǎo)致的免疫反應(yīng)過(guò)激與炎癥因子風(fēng)暴是上述并發(fā)癥產(chǎn)生,以及患者死亡的罪魁禍?zhǔn)譡3]。血必凈注射液是我國(guó)被批準(zhǔn)治療膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征及多器官衰竭的中成藥,由丹參、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎組成,起效迅速、療效顯著[13]。自COVID-19暴發(fā)以來(lái),血必凈注射液在治療危重型肺炎患者中發(fā)揮重要作用[14]。但其具體作用于SARS-Co V-2的分子機(jī)制尚不十分清楚。因此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù),從“藥物-靶點(diǎn)-通路”角度入手,探討血必凈注射液治療SARS-Co V-2的分子機(jī)制,為臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

利用TCMSP收集血必凈注射液共有116種活性成分。經(jīng)TCMSP、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)59個(gè)節(jié)點(diǎn),595條相互作用關(guān)系,其中關(guān)鍵成分29個(gè)。排序前十的核心化合物分別為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、山柰酚、丹參酮IIA、鼠尾草酚酮、4-亞甲丹參新酮、二氫異丹參酮。經(jīng)TTD、DisGeNT數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出COVID-19相關(guān)的免疫與抗炎相關(guān)靶點(diǎn)541個(gè),在這些靶點(diǎn)中,血必凈與COVID-19交集有75個(gè)共同靶點(diǎn)。構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖;利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,篩選出關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)55個(gè),關(guān)鍵活性成分4個(gè),864條相互作用關(guān)系。其中大于平均中介中心性0.014 5的關(guān)鍵靶點(diǎn)9個(gè),分別是PTGS2、IL6、PTGS1、ADRB2、NR3C1、PPARG、VEGFA、TP53、HSP90AA1。

GO富集分析結(jié)果顯示,與關(guān)鍵靶基因相關(guān)的生物過(guò)程主要涉及RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素調(diào)節(jié)信號(hào)通路、血管生成、免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等生物過(guò)程,提示血必凈注射液通過(guò)調(diào)控這些生物過(guò)程從而抗COVID-19。KEGG通路分析關(guān)鍵靶點(diǎn)與免疫炎癥相關(guān)27條,包括toll樣受體信號(hào)通路、甲型流感、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、炎癥性腸病(IBD)、NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞因子間受體的相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路,其中NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[15-16],可減輕SARS-Co V-2引起炎性因子釋放和異常增多,減少肝、肺、腎等組織的損傷[17-18]。同時(shí)發(fā)現(xiàn),IL6、PTGS2等靶點(diǎn)參與上述多條炎癥信號(hào)通路,表明血必凈注射液可通過(guò)免疫調(diào)節(jié),抑制細(xì)胞釋放炎性因子,從而降低SARS-Co V-2對(duì)肺組織的損傷,促進(jìn)肺部細(xì)胞的修復(fù)與再生,達(dá)到緩解肺炎癥狀的效果[19]。分子對(duì)接結(jié)果顯示,血必凈注射液主要活性成分與SARSCo V-2 3CL水解酶這一具有較好的結(jié)合活性,分子構(gòu)象結(jié)合穩(wěn)定,進(jìn)一步驗(yàn)證了血必凈注射液可通過(guò)與SARS-Co V-2靶蛋白結(jié)合起到抗COVID-19的作用。

綜上,本研究以血必凈注射液的活性成分、靶蛋白、信號(hào)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ),通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接揭示血必凈注射液對(duì)COVID-19免疫調(diào)節(jié)與抑制炎癥的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用血必凈治療重癥COVID-19患者提供理論參考。