安禎祥,張安邦,何遠利,黃 丹,王 敏,唐東昕,王 芳

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,貴州 貴陽550001)

肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是指肝臟中細胞外基質(zhì)的彌漫性過度沉積與異常分布,是肝臟的病理性修復(fù)反應(yīng),是慢性肝病向肝硬化/肝癌發(fā)展的關(guān)鍵步驟和重要環(huán)節(jié)。肝纖維化在組織學(xué)上是可逆的,而肝硬化難以逆轉(zhuǎn)[1]。有效地預(yù)防、逆轉(zhuǎn)肝纖維化可以延緩或防止肝硬化發(fā)生。目前尚無治療纖維化的化學(xué)或生物藥物,而中醫(yī)藥在該領(lǐng)域有明確的優(yōu)勢[2]?？估w維化治療是一個綜合治療,其中病因治療和抗炎治療是首要策略,但是針對細胞外基質(zhì)沉積和降解,抑制肝星狀細胞活化仍然是不能替代的治療。赤芍是活血涼血、散瘀止痛的代表藥物,廣泛用于急慢性肝病治療中。但是作為單一用藥,需進一步深入研究。赤芍(Paeoniae RadixRubra)為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactifloraPall.)或川赤芍(Paeonia veitchiiLynch)的干燥根,味苦,微寒,入肝經(jīng),具有涼血散瘀、清熱止痛的功效,可用于肝郁脅痛、癥瘕腹痛等肝膽疾病[3-5]。研究表明赤芍具有一定的保肝、抗肝纖維化作用[6-9]。然而其抗HF藥效物質(zhì)及作用機制需要進一步明確。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是多學(xué)科的交叉產(chǎn)物,利用系統(tǒng)生物學(xué)、系統(tǒng)藥理學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、計算機技術(shù)等,突破了傳統(tǒng)“單藥物、單靶點、單途徑”,切合中藥的“整體性、多靶點、多通道”特點,通過構(gòu)建藥物與基因、靶點和疾病之間的相互作用網(wǎng)絡(luò),探尋中藥的作用機制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對赤芍抗HF的活性成分、作用靶點和信號通路進行分析,探討其治療肝纖維化的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 赤芍活性成分與作用靶標(biāo)的篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選赤芍所有化學(xué)成分,以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(shù)(Drug like index,DL)≥0.18為篩選指標(biāo),活性成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索其作用靶標(biāo),運用Uniprot數(shù)據(jù)庫査詢靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因名稱。

1.2 肝纖維化疾病靶標(biāo)收集

以“hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞,檢索GeneCards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫、OMIM(https://www.omim.org)數(shù)據(jù)庫中肝纖維化相關(guān)基因,并去除重復(fù)基因。

1.3 赤芍活性成分靶點與肝纖維化靶點蛋白相互作用

將赤芍有效活性成分作用靶點與肝纖維化靶點取交集,得到兩者的韋恩圖。

1.4 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在GeneCards(http://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫中檢索肝纖維化疾病相關(guān)靶蛋白,物種設(shè)置為人類,利用Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫將其轉(zhuǎn)化為基因名稱,采用R語言提取成分作用靶點與肝纖維化疾病靶點的共有靶點,Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建赤芍活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與可視化

String(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫收集了大量的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(Protein-protein interactions,PPI)。將赤芍活性成分靶標(biāo)與肝纖維化疾病靶標(biāo)的共有靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,物種限定為“Homo sapiens(人)”,構(gòu)建赤芍成分靶標(biāo)-肝纖維化疾病靶標(biāo)PPI。采用R語言篩選出PPI中的前30個核心蛋白。使用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析和可視化處理,得到赤芍治療肝纖維化的蛋白相互作用的PPI柱狀圖和點狀圖。

1.5 基因功能及通路富集分析

Gene ontology(http://www.geneontology.org)廣泛用于基因功能的注釋。Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG,https://www.kegg.jp)是一個整合化學(xué)、基因組和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫,用于從分子水平信息中了解生物系統(tǒng)的高級功能和用途。將赤芍治療HF關(guān)鍵靶標(biāo)用R語言及Bioconductor進行基因功能和通路富集分析,通過條形圖及氣泡圖展示。

2 結(jié)果

2.1 赤芍活性成分與靶點篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索得到赤芍化合物119個,其中OB≥30%,DL≥0.18的活性成分29個,獲取赤芍化學(xué)成分及作用靶標(biāo)信息,包括芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶素、并沒食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃芩素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol等化合物。見表1。根據(jù)赤芍活性成分預(yù)測其作用靶標(biāo),12個活性成分共作用于74個靶標(biāo),去除重復(fù)靶標(biāo),獲得41個靶標(biāo),可見一個成分作用多個靶點,亦可見多個活性成分作用同一靶標(biāo)。運用Uniprot數(shù)據(jù)庫査詢靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因簡稱。見表2。

表1 赤芍的活性成分

表2 赤芍的藥物靶點

2.2 肝纖維化疾病靶標(biāo)收集結(jié)果

GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫收集HF疾病靶標(biāo)4 033個。肝纖維化主要通過CF跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)器、轉(zhuǎn)化生長因子Beta 1、腫瘤壞死因子、干擾素γ、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、IL6等靶點進行調(diào)節(jié)。圖3為部分靶點。

續(xù)表2

續(xù)表2

表3 肝纖維化部分靶點

續(xù)表3

2.3 赤芍成分靶點-肝纖維化靶點交集

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索得到赤芍治療疾病的靶標(biāo)41個,GeneCards數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫搜索HF疾病的靶點4 033個,使用R語言對赤芍作用靶點與肝纖維化的疾病靶點取交集,構(gòu)建赤芍活性成分靶點-肝纖維化靶點韋恩圖,獲得赤芍與HF共同作用靶標(biāo)33個。見圖1。

2.4 赤芍抗肝纖維化主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建赤芍抗肝纖維化成分-靶點網(wǎng)絡(luò),見圖2。其中一個疾病節(jié)點,1個藥物節(jié)點,12個藥物活性成分節(jié)點,33個肝纖維化相關(guān)基因節(jié)點,赤芍的12種活性成分協(xié)同作用于33個肝纖維化基因,三角形、橢圓形節(jié)點分別代表赤芍活性成分、疾病的靶蛋白,邊代表藥物、活性成分和疾病靶蛋白的相互作用,體現(xiàn)了赤芍抗肝纖維化多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。結(jié)果表明,赤芍29種活性成分中,與HF作用靶點直接相連的有12種活性成分,為赤芍治療HF的有效活性成分,分別為芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶酚、并沒食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃芩素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol?？梢姸鄠€成分同時作用于一個或幾個相同的靶點,部分靶點有多個作用成分,因此這些的靶點和成分成為赤芍中主要的活性成分和靶點。

圖2 赤芍-肝纖維化-成分-基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 赤芍靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING軟件,將韋恩圖中33個靶點作出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖及柱狀圖,結(jié)果IL6、VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、RELA、AR、CYCS、CASP8、PGR、CASP9、HIF1A、CCNB1等基因處于核心地位,分別有20、19、18、18、17、17、15、14、12、12、11、11、10節(jié)點。見圖3、圖4所示。

圖3 赤芍與HF共有PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 赤芍抗HF作用靶點PPI分析

2.6 赤芍治療肝纖維化基因功能富集分析

為進一步了解赤芍治療肝纖維化關(guān)鍵靶標(biāo)在生物體中發(fā)揮的作用,運行R語言對33個關(guān)鍵靶標(biāo)進行GO基因功能富集分析,共獲得73個生物學(xué)功能,根據(jù)P-vaule大小進行排序,選取前20條目展示,見圖5。柱狀圖中縱坐標(biāo)表示P值,橫坐標(biāo)表示富集的數(shù)目。P值越小顏色越深。結(jié)果顯示,赤芍治療肝纖維化關(guān)鍵靶標(biāo)主要富集在對DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶II特異性、核受體的活動、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體活性、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動功能活動中。

圖5 赤芍抗肝纖維化作用靶點的GO分析

2.7 赤芍治療肝纖維化通路富集分析

運行R語言對33個關(guān)鍵靶標(biāo)進行KEGG通路富集分析,符合篩選條件的信號通路有78條,顯示P值最小的前20條通路繪制氣泡圖,見圖6。氣泡圖中縱坐標(biāo)表示通路的名稱,橫坐標(biāo)表示通路所占比例。P值越小顏色越深。其中與肝纖維化相關(guān)程度密切的信號通路有細胞凋亡、Th17細胞分化、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路。赤芍抗HF部分通路圖(乙肝、IL-17信號通路、細胞凋亡)。見圖7-圖9。

圖6 赤芍抗肝纖維化作用靶點的KEGG分析氣泡圖

圖7 赤芍對乙型肝炎作用靶點的作用位置

圖9 赤芍對細胞凋亡作用靶點的作用位置

3 討論

肝纖維化屬于中醫(yī)“脅痛”“積聚”范疇,基本病機為正虛瘀積,肝絡(luò)受損,與肝絡(luò)病密切相關(guān)。肝絡(luò)是指肝臟的小血管,能營養(yǎng)肝臟及調(diào)節(jié)肝臟功能。肝纖維化病理關(guān)鍵為假小葉,假小葉病理基礎(chǔ)在肝血竇。肝絡(luò)與肝血竇的結(jié)構(gòu)與生理相似,具有密不可分的關(guān)系,因此從“絡(luò)病”治療肝纖維化是一個重要的方法[10]。赤芍具有活血化瘀功效,是絡(luò)病治療的較好選擇。

圖8 赤芍對IL-17信號通路作用靶點的作用位置

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫,按口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18的條件篩選赤芍活性化學(xué)成分29個,包括芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶素、并沒食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃 芩 素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol等 化合物,其中主要的化學(xué)成分是單萜苷類、酚類、多糖等化合物,單萜苷類含有芍藥苷、芍藥新苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷元酮、芍藥甙元酮、苯甲酰芍藥苷、苯甲酰羥基芍藥苷[11]。研究表明,赤芍中芍藥苷、兒茶素以及β-谷甾醇的量較高[12],這些化學(xué)成分為其功效的基礎(chǔ)。芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用[13]。芍藥苷對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化起保護作用[14];芍藥苷也可通過TGF-β1/Smads信號通路對放射引起的大鼠肝纖維化起保護作用[8,15]。β-谷甾醇對小鼠肝纖維化有保護作用,其機制可能與TGFβ/Smad2/3和TNF-α-NF-κB信號通路相關(guān)[16]?？上抡{(diào)Ⅰ型膠原纖維和α-SMA的基因和蛋白表達[17]。

從赤芍治療肝纖維化的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中,赤芍治療肝纖維化的效應(yīng)機制可能與IL6、VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、RELA、AR、CYCS、CASP8、PGR、CASP9、HIF1A、CCNB1等靶標(biāo)基因相關(guān)。肝竇毛細血管化則肝細胞物質(zhì)交換出現(xiàn)障礙。肝纖維化伴隨肝竇毛細血管化,肝臟新生血管與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[18]。組織缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)促進VEGF表達和轉(zhuǎn)錄增強,促進新血管生成,HIF-1α/VEGF信號通路是肝纖維化的重要調(diào)節(jié)通路[19]。IL-6與肝細胞炎癥壞死嚴重度及纖維化程度關(guān)系密切[20]。炎癥機制是各種病因所致慢性肝病發(fā)生發(fā)展的一個共同過程,是肝纖維化進展的核心機制,從這一機制著手進行肝纖維化診治具有重要價值[21]。NF-κB可通過調(diào)控多種抗炎因子的表達來影響肝纖維化的進展,NF-κB抑制劑也已在臨床上得到應(yīng)用。NF-κB對Ⅰ、Ⅲ型膠原基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)及肝纖維化的形成具有重要調(diào)節(jié)作用[22]。肝纖維化與NF-κB信號通路的多種炎癥介質(zhì)有關(guān)[23],NF-κB信號通路通過對肝細胞、HSC等細胞的調(diào)節(jié),影響肝纖維化的發(fā)展[24]。RELA是NF-κB通路中的主要活性成分,可影響肝纖維化的形成[25]。GO基因功能分析表明赤芍治療肝纖維化關(guān)鍵靶標(biāo)主要富集在DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制,細胞生長、凋亡功能活動中。KEGG通路富集分析,與肝纖維化密切相關(guān)的有細胞凋亡、Th17細胞分化、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路。研究表明,赤芍水提物影響bcl-2、bax、caspase-3三種蛋白表達,促進活化的HSC凋亡,減少酒精性肝纖維化的發(fā)生[26]?？梢姵嗌指深A(yù)治療肝纖維化具有多成分、多靶點的特點。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探析赤芍治療肝纖維化的分子機制,赤芍12個活性成分共作用于41個靶標(biāo),可見一個成分作用多個靶點,亦可見多個活性成分作用同一靶標(biāo),可影響細胞生長、凋亡、核受體活性、DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等生命活動,可通過細胞凋亡、Th17細胞分化、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路干預(yù)治療肝纖維化,多種活性成分通過多靶標(biāo)、多途徑、多通路、協(xié)同作用治療HF,為赤芍治療肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制提供了參考。