張慶蓮,皮鳳娟,黃 娟,許 曾,張世波

(瀘州市中醫(yī)醫(yī)院,四川 瀘州646000)

椒桂酊源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》中的藥熨方,由花椒、干姜、肉桂組成,藥味均有辛熱之性,具有溫陽散寒、通脈止痛的功效[1-2],可用于寒邪引起的各種疼痛,如寒痹、肩凝癥、心腹寒氣痛、跌打損傷、風(fēng)寒濕痹癥、盆腔炎等[3-4]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中藥熨方的用藥方法是連同藥渣一起外敷于患處[5],用藥過程麻煩,且不利于攜帶和保存,經(jīng)查閱文獻(xiàn),目前尚無將藥熨方開發(fā)為酊劑使用記載。因此,本研究將其開發(fā)為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑,經(jīng)系統(tǒng)研究,制成工藝穩(wěn)定、使用方便的酊劑。本研究采用正交試驗(yàn)法考察藥材粒度、浸出時間和乙醇濃度3個因素,以桂皮醛含量、總固體量兩種指標(biāo)進(jìn)行綜合評價,優(yōu)選出最佳提取工藝,為椒桂酊的工業(yè)化大生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

電子天平(FA2004型,上海安亭電子儀器廠),電子天平(SQP型,北京賽多利斯),電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-GF101-3-BS-Ⅱ/H型,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司),高效液相色譜儀(Agilent 1260型,美國安捷倫)。

1.2 試藥

桂皮醛對照品(純度99.6%,批號110710-201821,由中國食品藥品檢驗(yàn)研究院提供);花椒(批號191001131)、干姜(批號190302441)、肉桂(批號181201481),由成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司提供,3種藥材經(jīng)全檢,均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。3種中藥飲片經(jīng)主任中藥師張世波鑒定為正品。水采用超純水,乙腈采用色譜純,其余試劑采用分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 溶劑用量確定

對處方量藥材進(jìn)行吸醇率考察,按處方比例稱取適量藥材置于燒杯中,加60%、70%、80%3種濃度乙醇分別浸漬,在浸泡10 min、20 min、30 min、40 min、60 min、90min、120 min、180min、240min、360min、480min時間點(diǎn)測定相應(yīng)濃度的乙醇體積。以時間(min)為橫坐標(biāo),吸醇量(m L)為縱坐標(biāo),繪制不同加醇濃度在不同時間的吸醇率圖譜,見圖1。結(jié)果顯示,120 min后吸醇量增加緩慢并趨于平衡。為保證與傳統(tǒng)用藥一致,采用傳統(tǒng)提取工藝浸漬法進(jìn)行提取[6]。根據(jù)吸醇率考察結(jié)果看,120 min后吸醇量基本趨于平衡,此時的量約為藥材量的1.5倍。根據(jù)《中華人民共和國藥典》四部通則“酊劑”項(xiàng)下的要求,100 m L藥液相當(dāng)于20g藥材[7],即藥液比為1∶5,加上藥材吸醇量,根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,采用6倍量的溶劑浸漬,吸取上清液加入少量溶劑至規(guī)定量即可。

圖1 吸醇率

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[8-10]資料,選擇藥材粒度(因素A)、浸漬時間(因素B)與乙醇濃度(因素C)作為工藝考察的影響因素,采用4因素3水平正交試驗(yàn)表(即L9(34)正交表)對提取工藝進(jìn)行考察,以桂皮醛含量及總固體量兩種指標(biāo)為考察指標(biāo),綜合評分=(桂皮醛含量/桂皮醛含量最大值)×60+(總固體量/總固體量最大值)×40。因素與水平見表1。

表1 因素與水平

2.3 正交試驗(yàn)提取液的制備

稱取處方比例的藥材,按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表1、表6分別加入6倍量溶劑,浸漬一定天數(shù),濾過,定容即得。

2.4 總固體測定

將9個正交試驗(yàn)的浸漬液分別精密量取25 m L于已恒重的蒸發(fā)皿中,蒸干,放入105℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘3 h,取出,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定質(zhì)量,計(jì)算浸出物得率[11],見表6。

2.5 桂皮醛含量測定

2.5.1 對照品溶液制備 精密稱取桂皮醛對照品適量,加入乙腈至容量瓶中稀釋至刻度,搖勻,制成11.23 mg/m L的對照品母液;再精密量取桂皮醛對照品母液0.5 m L于10 m L容量瓶中,加入乙腈至容量瓶中稀釋至刻度,搖勻,制成11.23μg/m L的對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液制備 精密量取1 m L藥液,放入50 m L容量瓶中,將甲醇加入容量瓶中稀釋至刻度,搖勻后,再用0.45μm的微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5.3 陰性溶液制備 稱取缺肉桂的其他藥材,加入6倍量溶劑,浸漬,濾過,照供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備,即得陰性溶液。

2.5.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜條件為采用ZORBAX SB-C18(5μm,250mm×4.6mm)色譜柱;流動相比例為乙腈-水(35∶65);柱溫為30℃;流速為1 m L/min;檢測波長為290 nm。將桂皮醛對照品溶液、缺肉桂陰性溶液、椒桂酊供試品溶液,分別注入10μL于高效液相色譜液中測定峰面積,結(jié)果陰性無干擾。見圖2。

圖2 桂皮醛對照品、椒桂酊供試品、缺肉桂陰性溶液色譜

2.5.5 線性關(guān)系考察 精密量取已配制好的桂皮醛對照品母液0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2 m L,分別置于容量瓶中,加入色譜乙腈稀釋并定容至10 mL,根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件,分別注入10μL于高效液相色譜儀中進(jìn)行峰面積測定,以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程,結(jié)果為Y=182.52X+28.222(r=1),說明桂皮醛在1.123~16.845μg范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

2.5.6 精密度考察 精密量取桂皮醛對照品溶液,根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件,分別注入10μL于高效液相色譜儀中進(jìn)行峰面積測定,重復(fù)進(jìn)樣6次,結(jié)果RSD為0.42%,說明儀器精密度較好。見表2。

表2 精密度試驗(yàn)

2.5.7 重復(fù)性考察 取同一批次藥液6份,按“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備樣品,根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件,分別注入10μL于高效液相色譜儀中進(jìn)行峰面積測定,結(jié)果RSD為1.52%,說明重現(xiàn)性較好。見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

2.5.8 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液,按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件,分別于不同時間點(diǎn)(0、2、4、6、8h)注入10μL于高效液相色譜儀中進(jìn)行峰面積測定,結(jié)果RSD為0.83%,說明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取6份已知桂皮醛含量的樣品0.5 m L,分別加入桂皮醛對照品溶液,使其加入量相當(dāng)于樣品中桂皮醛含量的50%,按“2.5.2”項(xiàng)下方法處理樣品溶液,按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件測定含量,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為100.71%,RSD為1.06%(n=6),表明方法準(zhǔn)確度良好。見表5。

表5 回收率試驗(yàn)

2.6 正交結(jié)果

采用兩種指標(biāo)綜合評分,其中總固體量占40%,桂皮醛含量占60%,結(jié)果見表6、表7。

表6 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

根據(jù)表6、表7分析結(jié)果,因素A(藥材粒度)P<0.01對綜合評分結(jié)果有顯著性影響,因素B(浸漬時間)P>0.05、因素C(乙醇濃度)P>0.05對綜合評分結(jié)果無顯著性影響。根據(jù)表6中R值比較,影響因素大小為A>B>C。其中,因素A中K1>K2>K3,因素B中K3>K2>K1,因素C中K2>K3>K1,因此,優(yōu)選出的最佳工藝為A1B3C2,即藥材粒度為飲片,加6倍量70%乙醇,浸漬14 d。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝A1B3C2進(jìn)行提取,做3個驗(yàn)證試驗(yàn),測定桂皮醛含量及總固體量。結(jié)果桂皮醛平均含量為10.32 mg/g,RSD為2.93%,總固體平均含量為11.96%,RSD為0.19%,說明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

(1)試驗(yàn)過程中桂皮醛對照品采用2015年版《中華人民共和國藥典》中的制備方法,加入甲醇溶解,結(jié)果發(fā)現(xiàn),桂皮醛在甲醇中不穩(wěn)定。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[12]顯示,桂皮醛在甲醇中不穩(wěn)定,但在乙腈及乙酸乙酯中穩(wěn)定,因此含量測定中桂皮醛對照品溶液的配制采用乙腈溶解。

(2)由于中藥復(fù)方制劑藥味組成多,成分比較復(fù)雜,且兩種指標(biāo)或多種指標(biāo)加權(quán)評分可更好地控制中藥制劑的質(zhì)量。本研究中君藥花椒在2015年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定方法,臣藥干姜的有效成分6-姜辣素,預(yù)實(shí)驗(yàn)采用多種流動相及制樣方法測定,陰性均有干擾。因此,椒桂酊的提取工藝研究采用桂皮醛含量及總固體量兩種指標(biāo)進(jìn)行綜合評價。最終優(yōu)選出最佳提取工藝為加6倍量的70%乙醇浸漬14d,通過驗(yàn)證試驗(yàn)亦證明了工藝穩(wěn)定可行,因此,本研究可為椒桂酊規(guī)模生產(chǎn)提供參考。