姚世霞,王春瑤,朱旭江,胥順堂

(1.甘肅省藥品檢驗研究院,甘肅 蘭州730070;2.甘肅岷縣當歸研究院,甘肅 定西748400;3.甘肅天水岐黃藥業(yè)有限責任公司,甘肅 天水741000)

八珍補汁為黨參、當歸、川芎、甘草、白芍等八味藥材經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的煎膏劑,處方來源于氣血雙補中藥名方八珍湯,具有調(diào)補氣血的功效[1]?，F(xiàn)行標準為衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十四冊,此標準僅有常規(guī)煎膏劑的檢查項,缺少對藥味的關(guān)鍵質(zhì)控項目,急需進行標準的提升研究。在該處方中,當歸-川芎是廣為應(yīng)用的補血、活血藥對,其中當歸能補血養(yǎng)血,川芎可行血散血,兩藥配伍可協(xié)同增強養(yǎng)血和血、活血袪瘀的功效[2]。阿魏酸為當歸、川芎藥材中均含有的一種小分子酚酸[3],具有抗炎、活血等多種作用[4-7],本研究選擇阿魏酸為檢測指標,建立了HPLC測定八珍補汁中阿魏酸含量的方法,同時對處方中的當歸、川芎、白芍、甘草建立了TLC鑒別方法,提升了八珍補汁的質(zhì)量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A液相色譜儀;薄層自動成像儀(瑞士卡瑪);電子天平(Mettler ME 204);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

當歸對照藥材(批號:120927-201617),川芎對照藥材(批號:120918-201612),甘草對照藥材(批號:110723-201413),芍藥苷對照品(批號:110736-201943,含量95.1%),甘草酸銨對照品(批號:110731-202021,含量96.2%),白芍對照藥材(批號:120905-201610),阿魏酸對照品(批號:110773-201614,含量99.0%),均購于中檢院;八珍補汁樣品(批號分別為:180101、180102、181202、181203、181204,甘肅天水岐黃藥業(yè)有限責任公司提供);硅膠G板(青島海洋化工有限公司:20160322,阿拉丁公司:HX55160026);甲醇(色譜純),其余試劑等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 當歸、川芎的鑒別 取樣品15 g,用15 m L石油醚(30~60℃)振搖提取2次,合并石油醚液,揮干溶劑,殘渣加甲醇1m L使溶解,作為供試品溶液。取當歸、川芎對照藥材各0.5 g,同法制成相應(yīng)的對照藥材溶液。分別取處方中不含當歸、川芎的其余藥材,按處方工藝制備成陰性樣品,取10g,同法制備,作為陰性對照溶液。用微量毛細管吸取以上溶液各10μL,點于同一硅膠G薄層板上,在正己烷-乙酸乙酯(9∶1)溶液中展開,置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果,樣品在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的藍色熒光斑點,陰性無干擾,見圖1。

圖1 當歸、川芎的薄層鑒別色譜

2.1.2 甘草、白芍的鑒別 取本品15g,用30m L水飽和的正丁醇振搖提取3次,合并提取液,蒸干,殘渣加乙醇1m L使溶解,作為供試品溶液。取甘草對照藥材、白芍對照藥材各1g,分別加水50m L,煎煮30 min,過濾,濾液照供試品制備方法同法制備,分別作為對照藥材溶液。取芍藥苷對照品,用乙醇制成1 mg/m L的溶液。分別取不含甘草和不含白芍的陰性樣品,稱取14 g,按照供試品溶液制備方法同法制備,作為缺甘草的陰性對照溶液和缺白芍的陰性對照溶液。微量毛細管吸收上述5種溶液各10μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,在乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)溶液中展開,以10%硫酸乙醇溶液顯色,熱風吹至斑點顯色清晰。結(jié)果,樣品色譜中,在與白芍、甘草對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性未見干擾。見圖2。

圖2 白芍、甘草的薄層鑒別色譜

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent HC-18 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流動相為甲醇-4%冰醋酸(22∶78),柱溫30℃,流速:1.0m L/min,進樣量:10μL;檢測波長為320 nm。

2.2.2 溶液的制備 精密稱取本品10 g,置25 m L量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即為供試品溶液。稱取阿魏酸對照品11.84 mg,加甲醇制成濃度為9.38μg/m L的對照品溶液。取處方中除去當歸、川芎的其他藥味,按照制法制備成陰性樣品,取8 g,按照供試品溶液制備方法同法制備,即為陰性對照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2.2”項下制成的3種溶液各10μL,注入液相色譜儀,分別計算出理論塔板數(shù)>5 000,供試品溶液色譜中阿魏酸及相鄰峰分離度>1.5,拖尾因子為1.02,滿足系統(tǒng)適用性測定要求。

2.2.4 專屬性試驗 取“2.2.2”項下制成的3種溶液各10μL,按“2.2.1”項下條件測定。結(jié)果表明在上述液相色譜條件下,供試品色譜中阿魏酸的峰形對稱,分離度>1.5,且陰性對照對測定無干擾。見圖3。

圖3 八珍補汁的HPLC色譜

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.1”項下制成的對照品溶液10μL,重復(fù)進樣6次,6次峰面積的RSD為2.5%,顯示方法的精密度符合要求。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號181204)6份,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進樣,計算6份含量的平均值為8.4μg/g,RSD為1.6%,表明重復(fù)性較好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液(批號181204),分別在0、4、8、12、16 h進樣,結(jié)果供試品溶液在16h峰面積的RSD為0.8%,表明16h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 線性范圍考察 精密吸取“2.2.1”項下的對照品溶液2、5、10、15、20、25、40μL,注入液相色譜儀,測定峰面積積分值,以對照品溶液的進樣量(X,μg)對峰面積積分值(Y)計算線性回歸方程。線性回歸方程為:Y=5.496 0×106X,r=1,表明阿魏酸在0.017 0~0.340 8 g范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.9 耐用性考察 取同一批號樣品,在3個不同品牌的色譜柱(Agilent HC-18、月旭C18、Agilent TC-18)上測定,結(jié)果RSD為1.4%。采用不同的高效液相色譜儀(島津LC-20A、Waters e2695、日立液相色譜儀)測定,結(jié)果RSD為2.1%,符合液相方法中對耐用性的要求。

2.2.10 回收率測定 取50m L量瓶9個,分為3組,每組3個,分別按樣品含量的50%、100%、150%,精密加入一定量的對照品溶液,氮氣吹干,然后再向瓶中精密加入樣品,每份約5 g,按“2.2.2”項下供試品溶液同法制備,進樣測定,結(jié)果平均回收率為99.7%,RSD為2.7%,見表1。

表1 回收率測定結(jié)果

2.2.11 樣品測定 按照擬定的方法測定5批樣品含量,結(jié)果見表2。

表2 含量測定結(jié)果

3 討論

(1)通過建立2個TLC鑒別方法,有效鑒別出八珍補汁中的4種藥味,操作簡便,省時省力。建立的方法分別經(jīng)過不同的溫濕度、不同品牌硅膠板及不同點樣的量的驗證,彌補了現(xiàn)行標準鑒別的缺項。

(2)考察了3種流動相[甲醇-4%冰醋酸(22∶78)、甲醇-2%冰醋酸(25∶75)、乙腈-0.1%磷酸(17∶83)]和2種提取溶劑(甲醇、50%甲醇),結(jié)果3種流動相均能達到系統(tǒng)適用性要求,甲醇-4%冰醋酸(22∶78)為流動相時阿魏酸的峰形較好,分離度更高;以甲醇為溶劑時,樣品中阿魏酸更高。因此以甲醇為提取溶劑、甲醇-4%冰醋酸(22∶78)作為測定用流動相。