盧佳慧，朱熹，黃天濠，劉雅文，倪晨，莊銀蘋，時(shí)梅林，胡俊峰

乳腺癌是女性最常見且致死率高的惡性腫瘤之一，發(fā)病具有年輕化的趨勢(shì)，起病隱匿的特征使得部分患者確診時(shí)已是癌癥中晚期，錯(cuò)過了最佳的手術(shù)保乳時(shí)機(jī)。為了更好地控制病情的進(jìn)展，早期診斷和及時(shí)治療對(duì)乳腺癌患者具有重要的臨床意義[1,2]。分子影像對(duì)病變的檢測(cè)具有極高的敏感性，可在分子或細(xì)胞層面檢測(cè)到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前，能否構(gòu)建出新型分子探針，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞層面上對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的可視化檢測(cè)，并對(duì)早期治療進(jìn)行指導(dǎo)，是當(dāng)前分子影像學(xué)在乳腺癌的診療中亟待解決的熱點(diǎn)問題[3]?；铙wMRI不受組織深度的影響，可以較好地觀察組織器官的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，適用于絕大多數(shù)腫瘤的成像?；铙w熒光成像由于熒光穿透深度有限，主要應(yīng)用于表淺性腫瘤的成像。光熱治療則是憑借光熱轉(zhuǎn)換劑可在近紅外激光下吸收能量并轉(zhuǎn)換為熱能的性能，通過提高局部溫度來殺傷癌細(xì)胞的一種腫瘤治療策略，具有侵入性小、選擇性高以及可控性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[4]。但其穿透深度不足，因此主要適用于表淺腫瘤(如乳腺癌，黑色素瘤等)的早期治療。乳腺癌屬于表淺性腫瘤，在實(shí)現(xiàn)活體熒光成像及光熱治療上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

本研究擬構(gòu)建一種新型診療納米粒子--介孔二氧化硅(mesoporous silicon,MSN)-聚多巴胺(polydopamine,PDA)核殼納米粒子(MSN-Ce6@PDA-Gd nanoparticles,MSN-Ce6@PDA-Gd NPs)，以實(shí)現(xiàn)乳腺癌的分子影像及光熱治療。此新型納米粒子所借助的核殼納米載體介孔二氧化硅-聚多巴胺具有生物相容性好、負(fù)載能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，既可穩(wěn)定遞送熒光成像劑二氫卟吩e6(chlorine e6，Ce6)，亦具有能進(jìn)行磁共振T1WI的釓離子(Gd)，并憑借聚多巴胺具有光吸收和熱轉(zhuǎn)換的性能。本研究中對(duì)此新型診療納米粒子在體內(nèi)、外行磁共振-熒光雙模態(tài)成像的潛能以及介導(dǎo)光熱治療乳腺癌的效能進(jìn)行了探討。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑中十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammoniumchloride，CTAC)、氯化鈉、三乙胺、環(huán)己烷、正硅酸四乙酯和甲醇，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國(guó))；二氫卟吩e6購(gòu)于Frontiersci公司(美國(guó))；鹽酸多巴胺購(gòu)于Aladdin公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷和氯化釓(GdCl3·6H2O)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司(美國(guó))。

試驗(yàn)設(shè)備和材料：德國(guó)Sigma 3-30KS離心機(jī)；美國(guó)DMI3000B透射電子顯微鏡；英國(guó)Nano ZS90馬爾文粒徑分析儀；UH4150紫外可見分光光度計(jì)；德國(guó)Leica倒置熒光顯微鏡；美國(guó)Biotek酶標(biāo)儀；GE Discovery 750W 3.0T磁共振儀和GE AW4.6后處理工作站；PSU-Ⅲ型激光器；美國(guó)Fotric紅外熱成像儀；美國(guó)Bio-Rad熒光成像系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性健康無特定病原體級(jí)昆明小鼠6只(鼠齡6周)以及雌性BALA/C裸鼠6只(鼠齡6周)，均購(gòu)于徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理道德管理委員會(huì)的規(guī)定進(jìn)行。

2.藥物制備和性能檢測(cè)

氨基化介孔二氧化硅(aminated mesoporous silicon,MSN-NH2)的制備參考Dai等[5]的方法并進(jìn)行了改良，具體步驟：(1)將26 mL純水、20 mL百分比濃度為25%的CTAC及250 μL三乙胺溶液倒入圓底燒瓶中，置于70℃水浴中反應(yīng)1 h，再加入20 mL環(huán)己烷與正硅酸乙酯的混合液后繼續(xù)反應(yīng)24 h后，使用百分比濃度為1%的氯化鈉-無水甲醇溶液進(jìn)行脫模板，得到介孔二氧化硅。(2)采用甲苯回流法進(jìn)一步制備氨基化MSN。稱取150 mg MSN粉末置于燒瓶中，并加入10 mL無水甲苯，待水浴溫度達(dá)到70℃后，加入15 μL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在氮?dú)夥諊吕^續(xù)反應(yīng)4 h。收集所得混合液進(jìn)行離心洗滌，并冷凍干燥以備用。

MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的制備：將1.0 mL Ce6溶液(3.0 g/L)分別加入不同質(zhì)量(3.0、4.5、6.0、7.5和9.0 mg)的MSN-NH2中，室溫下攪拌一夜，所得混合液進(jìn)行充分的離心洗滌，直至上清液接近無色，再向沉淀中加入2.5 mL鹽酸多巴胺溶液(10.0 g/L，Tris-HCl緩沖液)攪拌6 h，隨后加入2.5 mL GdCl3·6H2O溶液(10.0 g/L)繼續(xù)攪拌4 h。最后將此混合液進(jìn)行3次高速離心洗滌(離心半徑65 mm，20 min，14100 rpm)，即可得到MSN-Ce6@PDA-Gd NPs。全程避光操作。

使用透射電子顯微鏡及Nano ZS90儀器測(cè)量所制備納米材料的形貌、粒徑和表面電位；使用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)MSN與Ce6不同配比的上清液的吸收光譜，以計(jì)算Ce6的包封率和負(fù)載量；使用熒光發(fā)射光譜檢驗(yàn)所制備MSN-Ce6的熒光強(qiáng)度；使用紅外熱成像儀監(jiān)測(cè)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs在808nm激光照射下的升溫情況；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各種處理下MSN的吸光度。

3.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)(cell proliferation and cytotoxicity test，MTT)分析此納米診療劑對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)和人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)活性的影響。以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到80%左右，然后分別加入含不同濃度(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液的新鮮培養(yǎng)基(每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，使每孔最終體積為100 μL)孵育24 h。使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗3遍后，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)液以及20 μL噻唑藍(lán)MTT溶液(5.0 g/L)，孵育4 h后棄上清。每孔再加入100 μL二甲亞砜溶液，并放入恒溫?fù)u床振蕩15 min。最后使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度，并計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率。

4.MRI和熒光成像性能離體檢測(cè)

MRI性能檢測(cè)：配置含不同Gd濃度(0、0.0106、0.0408、0.3260、0.4091、0.5168和0.9438 mmol/L)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs水溶液，每種濃度的溶液各取500 μL注于0.5 mL的離心管中，以純水為對(duì)照組，使用3.0T MR掃描儀進(jìn)行掃描，通過采集T1弛豫時(shí)間并計(jì)算T1弛豫率，來觀察其MRI性能。為進(jìn)一步檢測(cè)此納米材料與細(xì)胞結(jié)合后的T1WI效果，將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的種植密度接種于6孔板內(nèi)，然后放于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到80%左右，棄去培養(yǎng)基并對(duì)6孔板內(nèi)的細(xì)胞使用PBS洗滌兩次，然后吸出PBS，再向6孔板內(nèi)分別加入2 mL不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液(0.0、50.0、100.0和200.0 mg/L)與細(xì)胞孵育3 h，對(duì)照組加入相同體積的PBS與細(xì)胞孵育3 h。使用胰酶將貼壁的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231進(jìn)行消化，并將得到的懸浮細(xì)胞收集至離心管內(nèi)，經(jīng)離心(離心半徑76 cm，5 min，3000 rpm)后使細(xì)胞沉積于管底，經(jīng)細(xì)胞攝入的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs也會(huì)沉入管底，向每個(gè)離心管內(nèi)加入等體積的PBS后行MRI冠狀面掃描。掃描參數(shù)：TR 425 ms，TE 14.0 ms;視野18 cm×18 cm，層厚3.0 cm。

熒光成像性能檢測(cè)：以4×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板的蓋玻片上，過夜孵育使細(xì)胞貼壁，隨后向含有細(xì)胞的6孔板內(nèi)分別加入含不同Ce6濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs(0，4，8，16 mg/L)的培養(yǎng)基，并共同孵育4h。依次進(jìn)行PBS漂洗、4%多聚甲醛固定細(xì)胞、細(xì)胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復(fù)染以及再次PBS漂洗等步驟。最后使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行成像(×20)。Ce6的激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為665 nm，DAPI的激發(fā)波長(zhǎng)為358 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為461 nm。

5.光熱性能和光熱治療效果檢測(cè)

配置不同濃度(0.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液，吸取1.0 mL于石英比色皿中，使用808 nm激光以1.5W/cm2的強(qiáng)度照射10 min，在紅外熱成像儀監(jiān)測(cè)下每30 s記錄一次溫度值，并繪制升溫曲線。

為了進(jìn)一步探究此納米材料對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的光熱治療效果，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種MDA-MB-231細(xì)胞于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到80%左右，向96孔板內(nèi)加入不同濃度(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液后孵育4 h。換液后非激光組直接放入恒溫培養(yǎng)箱，激光組采用808 nm以1.5W/cm2的強(qiáng)度照射3 min后放入恒溫培養(yǎng)箱，后續(xù)步驟同細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。最后，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率以評(píng)估光熱治療(photothermal therapy,PTT)的療效。

6.體內(nèi)生物相容性分析

選取雌性健康無特定病原體級(jí)的昆明小鼠6只，鼠齡6周，體質(zhì)量(32±2) g。對(duì)照組(n=3)不進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)組(n=3)注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液。根據(jù)昆明小鼠血容量為體重的6%～7%計(jì)算，其血容量約為2.0 mL。為保證納米材料在小鼠血液循環(huán)中能保持200 mg/L的濃度，因此經(jīng)昆明小鼠尾靜脈注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的劑量為20 mg/kg。在注射后第21天經(jīng)解剖獲得小鼠的心、肝、脾、肺和腎臟標(biāo)本，經(jīng)過固定后使用蘇木精-伊紅染色法制作病理切片，在顯微鏡下觀察各器官的組織結(jié)構(gòu)。

7.體內(nèi)代謝途徑及半衰期

將MSN-Ce6@PDA-Gd NPs(20 mg/kg，200 μL)經(jīng)尾靜脈注射入3只乳腺癌荷瘤裸鼠體內(nèi)，在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)(0、2、6和12 h)采集裸鼠的全身磁共振圖像，觀察此納米材料的代謝途徑。MRI檢查掃描參數(shù)：冠狀面GRE T1WI，TR 11.2 ms,TE 3 ms，TI 28.0 ms，層厚1.0 mm，層間距0.5 mm。此外，在注射后不同時(shí)間點(diǎn)(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00和12.00 h)對(duì)荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈取血，將血液與濃硝酸以體積比1/10的比例進(jìn)行充分混合，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)的方法ICP-MS法對(duì)血液樣品中釓離子的含量進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算Gd在體內(nèi)的半衰期。

8.在體MRI及熒光成像性能

將人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)懸液注射到BALB/C雌性裸鼠的右側(cè)腋背部皮下軟組織內(nèi)，待乳腺癌皮下移植瘤長(zhǎng)出，即成功建立荷瘤裸鼠模型。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、腫瘤大小接近的兩只荷瘤裸鼠。在注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs(劑量20 mg/kg)前、后的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0)分別對(duì)荷瘤裸鼠的腫瘤區(qū)域進(jìn)行MRI和熒光成像，觀察腫瘤的成像情況。MRI掃描參數(shù)：冠狀面GRE T1WI，TR 11.2 ms，TE 3 ms，TI 28.0 ms，層厚1.0 mm，層間距0.5 mm。熒光成像時(shí)每幀圖片的曝光時(shí)間為白光50 ms、綠光150 ms。

9.在體光熱治療效能

將建立成功(荷瘤裸鼠腋下腫瘤生長(zhǎng)至直徑約5 mm)的6只荷瘤裸鼠模型隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)樣本。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組荷瘤裸鼠分別經(jīng)尾靜脈注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs(20 mg/kg)和200 μL生理鹽水。待腫瘤體積達(dá)到50 mm3時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠進(jìn)行治療。經(jīng)尾靜脈注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs后2 h進(jìn)行激光照射(波長(zhǎng)808 nm，強(qiáng)度1.5W/cm2，時(shí)間10 min)，每三天治療一次，治療期為兩周，在治療前和治療結(jié)束后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用相機(jī)和磁共振掃描儀進(jìn)行檢查。對(duì)照組的荷瘤裸鼠不進(jìn)行治療。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.理化性能表征

透射電鏡圖顯示MSN-NH2具有明顯的介孔結(jié)構(gòu)，且孔徑和大小均一。MSN-Ce6@PDA-Gd NPs亦呈圓形，介孔結(jié)構(gòu)模糊，表面較為光滑(圖1a)，提示材料合成成功。Zeta電位監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示MSN-NH2的Zeta電位值為正值，而經(jīng)過制備的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的Zeta電位值已成功變?yōu)樨?fù)值，測(cè)量值為(-16.03±0.12) mV(圖1b)。經(jīng)馬爾文粒徑檢測(cè)結(jié)果，MSN-NH2和MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的水合粒徑分別為(122.03±0.21)和(142.10±0.29) nm(圖1c)。根據(jù)離心所得上清液的紫外吸收光譜測(cè)量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MSN-NH2與Ce6的質(zhì)量比為2.5時(shí)，Ce6的包封率(53.58%)和負(fù)載量(17.65%)較好(圖1d)，因此最終選擇該配比制備納米材料來進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的表征。a)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs和MSN-NH2(左下)的透射電鏡圖；b)MSN-NH2和MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的電位圖；c)MSN-NH2和MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的粒徑-光強(qiáng)度分布曲線；d)不同質(zhì)量比的MSN-NH2與Ce6混合液離心所得上清液的紫外吸收光譜圖，顯示不同質(zhì)量比得到的產(chǎn)物在404、505和660nm的吸光度峰值均不同。 圖2 兩種類型腫瘤細(xì)胞與不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液共同孵育后細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在0～200mg/L的濃度范圍內(nèi)細(xì)胞存活率均在90%以上。

2.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3及人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231與不同濃度(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液孵育后，細(xì)胞存活率均在90%以上(圖2)，總體差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FNIH-3T3=2.317，P>0.05；FMDA-MB-231=2.344，P>0.05)。

3.MRI和熒光成像性能

MRI性能檢測(cè)：在MR T1WI上，PBS對(duì)照組在T1WI上呈低信號(hào)；實(shí)驗(yàn)組中，隨著納米材料中Gd濃度的升高(0、0.0106、0.0408、0.3260、0.4091、0.5168和0.9438 mmol/L)，在T1WI上信號(hào)呈逐漸增高的趨勢(shì)，在相應(yīng)的T1值偽彩圖上表現(xiàn)為由綠色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，提示T1值逐漸減小(圖3a)；對(duì)應(yīng)的T1弛豫時(shí)間測(cè)量結(jié)果依次為(2115.83±0.60)、(232.24±1.01)、(203.57±0.46)、(175.53±0.46)、(113.97±0.33)、(89.10±0.16)和(69.07±0.35) ms。相關(guān)性分析結(jié)果見圖3b，顯示Gd濃度與T1值的倒數(shù)呈良好的線性正相關(guān)關(guān)系(R2=0.9984)。不同濃度的納米診療劑與人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231結(jié)合后經(jīng)離心而沉積于EP管底部，在冠狀面T1WI上可見隨著納米診療劑濃度的增加(0～200 mg/L)，離心管底部的信號(hào)強(qiáng)度逐漸增高，在T1-rainbow偽彩圖上離心管底部的顏色由藍(lán)色過度到綠色、最后至紅色(圖3c)，表明沉積細(xì)胞的T1值逐漸減小。結(jié)果表明MSN-Ce6@PDA-Gd NPs具有良好的T1加權(quán)成像能力。

圖3 MRI性能檢測(cè)結(jié)果。a) 不同Gd濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的MR T1WI圖像及T1-mapping偽彩圖； b) Gd濃度與1/T1值的相關(guān)性分析點(diǎn)線圖，顯示兩者間呈良好的線性相關(guān)關(guān)系； c) 不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液與MDA-MB-231細(xì)胞孵育后置入離心管內(nèi)后的T1WI圖像及T1-rainbow偽彩圖，顯示隨著納米材料的濃度增加，在T1WI上信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，而T1值逐漸減小(在T1-rainbow偽彩圖上的顏色依次為藍(lán)色-綠色-紅色)。

熒光成像性能表征：采用倒置熒光顯微鏡觀察MDA-MB-231細(xì)胞與納米診療劑的結(jié)合情況，由于DAPI是一種能與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，與細(xì)胞中的DNA結(jié)合后顯示為藍(lán)色熒光，因此DAPI通道中顯示的藍(lán)色熒光為細(xì)胞核區(qū)域；由于Ce6的可在熒光激發(fā)下顯示為紅色熒光，因此Ce6通道中顯示的紅色熒光反映了MSN-Ce6@PDA-Gd NPs在細(xì)胞內(nèi)的分布；Merge通道中顯示的是藍(lán)色熒光和紅色熒光的融合，可觀察MSN-Ce6@PDA-Gd NPs在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。本研究中發(fā)現(xiàn)PBS組中僅觀察到藍(lán)色熒光，無紅色熒光；以PBS為對(duì)照組，將細(xì)胞懸液加入含不同Ce6濃度(4、8和16 mg/L)的MSN-Ce6@PDA-GdNPs溶液(依次簡(jiǎn)稱為NP-4、NP-8和NP-16組)的培養(yǎng)基中孵育4 h后，細(xì)胞懸液中則觀察到明顯的紅色熒光，且隨著Ce6濃度的增加在顯微鏡圖像上的熒光亮度逐漸提高(圖4)。使用Image J軟件進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度的半定量分析，結(jié)果顯示NP-4、NP-8和NP-16這3組的單個(gè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值分別為54.47±1.14、65.35±0.99和103.87±1.07，3組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4298.203，P<0.001)；NP-4和NP-8組分別與NP-16組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=44.679，P<0.001；t=37.294，P<0.001)。上述結(jié)果表明人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)對(duì)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的攝入具有濃度依賴性，當(dāng)其內(nèi)Ce6的濃度為16 mg/L時(shí)乳腺癌細(xì)胞具有較好的熒光顯像效果。

圖4 倒置熒光顯微鏡檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)納米診療劑的攝取情況(標(biāo)尺長(zhǎng)度代表100nm，×20)。含有PBS溶液及含有不同Ce6濃度(4、8、16mg/L)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液的培養(yǎng)基與人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231細(xì)胞)共同孵育后，熒光顯微鏡下DAPI通道可見細(xì)胞核區(qū)域呈藍(lán)色熒光；Ce6通道可觀察到，相較于對(duì)照組(PBS組)，實(shí)驗(yàn)組隨著Ce6濃度濃度的增加(NP-4、NP-8和NP-16)，紅色熒光的亮度逐漸增強(qiáng)；Merge通道可見紅色與藍(lán)色區(qū)域不重疊，表明MSN-Ce6@PDA-Gd NPs不進(jìn)入細(xì)胞核。

4.光熱性能和光熱治療效果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著激光照射時(shí)間的增加，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液的溫度逐漸升高并趨于平衡(圖5a)。在808 nm激光輻照(1.5W/cm2，)10 min后，150 mg/L組溶液溫度可達(dá)到43.7℃，200 mg/L組溶液溫度可高達(dá)51.5℃。細(xì)胞光熱治療作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在激光輻照組中，當(dāng)納米材料的濃度為0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/時(shí)，細(xì)胞存活率分別為100.83%±4.68%、95.51%±2.30%、92.07%±1.15%、89.18%±1.08%、68.74%±0.57%、43.83%±2.22%和23.07%±1.41%，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=793.216，P<0.001)。無激光輻照組中各濃度(0～200 mg/L)的納米材料以及激光輻照組中納米材料的濃度為0～50 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率較高；而在激光輻照組中當(dāng)納米材料的濃度達(dá)100～200 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低(圖5b)。

圖5 MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的光熱效能。a)PBS溶液以及不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液在激光照射下(808 nm,1.5W/cm2,10 min)的升溫曲線；b)不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液在有或無激光處理后的細(xì)胞存活率條形圖。

5.納米材料在體內(nèi)的生物相容性

21天后的蘇木精-伊紅染色后的組織切片結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs組的昆明小鼠體內(nèi)臟器(心、肝、腎臟、肺和脾)無明顯異常(圖6)。表明該核殼納米診療劑具有良好的體內(nèi)生物相容性。

圖6 各臟器的組織病理圖(×400，HE)。圖a～e依次為對(duì)照組中小鼠的心、肝、腎臟、肺和脾臟標(biāo)本的病理圖，圖f～j依次為實(shí)驗(yàn)組在注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液21天時(shí)小鼠的心、肝、腎臟、肺和脾臟標(biāo)本的病理圖。兩組小鼠的心肌組織均顯示肌纖維正常分布，細(xì)胞橫紋清晰，間質(zhì)細(xì)胞正常，胞核完整，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；兩組小鼠的肝臟組織均顯示肝細(xì)胞索間界限清晰，胞漿界限明顯，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍放射狀排列；兩組小鼠的腎臟組織均顯示胞核完整，細(xì)胞核清晰可見，胞質(zhì)和胞漿對(duì)比鮮明；兩組小鼠的脾臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)均顯示清晰，紅髓和白髓界限較明顯。

6.體內(nèi)代謝途徑及半衰期

荷瘤裸鼠在注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs后，增強(qiáng)早期在MR T1WI上即可見肝臟有較明顯強(qiáng)化，隨著時(shí)間推移，強(qiáng)化程度逐漸減低，12 h后肝臟信號(hào)強(qiáng)度恢復(fù)至注射前(圖7)。提示MSN-Ce6@PDA-Gd NPs通過肝臟進(jìn)行排泄。此外，以荷瘤裸鼠注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs后的取血時(shí)間為橫坐標(biāo)，以電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)得的血液樣品中的Gd濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖及計(jì)算，獲得其代謝曲線(圖8)，結(jié)果顯示此納米材料中Gd的血液半衰期約為2.03 h。

圖7 荷瘤裸鼠在注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液前、后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MRI圖像。a)T1- rainbow偽彩圖顯示肝臟(箭)在0 h時(shí)呈綠色。注射后2 h黃色區(qū)域增加，6h時(shí)黃色區(qū)域較前減少，12 h時(shí)恢復(fù)至綠色，由于rainbow偽彩圖上的顏色藍(lán)色-綠色-黃色-紅色代表T1值逐漸由高到低，因此結(jié)果表明肝臟區(qū)域的T1值先減小，6 h后增加，再至12 h恢復(fù)至接近初始水平；b)T1WI顯示注射后2 h肝臟區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度增高，6 h時(shí)肝臟的信號(hào)強(qiáng)度減弱，在12 h時(shí)肝臟的信號(hào)強(qiáng)度恢復(fù)至與0 h時(shí)接近。

7.在體磁共振及熒光成像性能

在獲得較好的體外成像效果后，我們進(jìn)一步評(píng)估了MSN-Ce6@PDA-Gd NPs活體成像效果。荷瘤裸鼠的在體MRI和熒光成像檢查顯示，注射此納米診療劑后腫瘤區(qū)域有明顯強(qiáng)化(圖9a)和明顯的熒光強(qiáng)化(圖9b)。在體成像結(jié)果表明MSN-Ce6@PDA-Gd NPs可實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌病灶的在體MR和熒光雙模態(tài)成像。

圖8 血液內(nèi)Gd離子濃度-時(shí)間曲線，Gd離子濃度在體內(nèi)的半衰期為2.03±0.31 。 圖9 荷瘤裸鼠在體MRI及熒光成像。a)MR T1WI顯示注射納米診療劑后腫瘤組織有明顯強(qiáng)化(箭)；b)熒光成像圖(顯示注射納米診療劑后腫瘤組織有明顯熒光強(qiáng)化(箭)。 圖10 MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的光熱治療性能檢測(cè)。圖a～d為對(duì)照組(注射生理鹽水)圖像，圖e～h為實(shí)驗(yàn)組(注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs)圖像。a)治療前對(duì)照組裸鼠照片；b)激光輻照治療結(jié)束后對(duì)照組裸鼠照片，顯示皮下腫瘤(箭)較前明顯增大；c)治療前對(duì)照組裸鼠MR T1WI；d)激光輻照治療后對(duì)照組裸鼠T1WI，顯示腫瘤(箭)較治療前明顯增大；e)治療前實(shí)驗(yàn)組裸鼠照片；f)治療后實(shí)驗(yàn)組裸鼠照片，顯示皮下腫瘤(箭)較前明顯減小；g)治療前實(shí)驗(yàn)組裸鼠MR T1WI；h)激光輻照治療后實(shí)驗(yàn)組裸鼠T1WI，顯示瘤體(箭)較前明顯減小。

8.在體光熱治療效能

在治療前及激光輻照治療兩周后進(jìn)行在體光熱治療效能的評(píng)估。裸鼠照片及MR圖像顯示，對(duì)照組中裸鼠皮下的腫瘤組織明顯大于未治療時(shí)(圖10a)；而注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs結(jié)合808 nm激光組裸鼠的腫瘤在治療后小于治療前的大小，且該組瘤體的大小明顯小于對(duì)照組(圖10b)。本組結(jié)果表明了MSN-Ce6@PDA-Gd NPs+808 nm激光能實(shí)現(xiàn)有效的乳腺癌在體光熱治療。

討 論

分子影像中MRI和熒光成像雙模態(tài)成像技術(shù)兼具M(jìn)RI的空間分辨率高、不受組織深度影響以及熒光成像的時(shí)間分辨率高、可實(shí)時(shí)成像的優(yōu)點(diǎn)，可作為乳腺癌早期診斷的有效手段[6-7]。第二代光敏劑二氫卟吩e6(chlorine e6，Ce6)具有光穩(wěn)定性好，成像性能佳的優(yōu)點(diǎn)，其激發(fā)光為紅色熒光，可有效區(qū)別生物體的黃綠色背景熒光，是一種性能優(yōu)異的熒光成像劑[8]。但強(qiáng)疏水性使Ce6易發(fā)生團(tuán)聚，進(jìn)而將顯著影響其在腫瘤細(xì)胞中的攝取[9]。本研究中采用負(fù)載潛能高的介孔二氧化硅為載體，并與親水性能良好的聚多巴胺涂層聯(lián)合使用，以提高對(duì)疏水性光敏劑Ce6的負(fù)載性能。值得一提的是，本研究所使用的聚多巴胺涂層，是金屬離子(如釓離子﹑錳離子和鐵離子)的強(qiáng)配位體，故具有成為MRI對(duì)比劑的潛能[10]，還具備近紅外光吸收和光熱轉(zhuǎn)換能力，是一種有效的光熱治療劑。因此，本研究中所構(gòu)建出的多功能納米體系可具有磁共振和熒光成像能力及光熱治療效能。

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231屬于高轉(zhuǎn)移性惡性乳腺癌細(xì)胞系，呈貼壁生長(zhǎng)，其形態(tài)為上皮細(xì)胞樣，是研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的經(jīng)典模型細(xì)胞系[11]。因此，本研究中使用該細(xì)胞系用于后續(xù)的研究。細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，當(dāng)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的濃度為0～200 mg/L時(shí)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的相對(duì)存活率均維持在90%以上。相較于Dong等[12]制備的錳配位聚多巴胺溶液的細(xì)胞存活濃度范圍(0～80 mg/L)，以及Yang等[13]制備的介孔硅裝載二氫卟吩e6的細(xì)胞存活濃度范圍(0～200 mg/L)，本研究中制備的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的細(xì)胞毒性較低。此外，與空白對(duì)照組比較，此納米材料經(jīng)昆明小鼠尾靜脈注射后21天的病理切片可觀察到，所有被檢器官均無明顯的器質(zhì)性病變﹑炎癥和其它異常。

本次研究中對(duì)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的磁共振成像和熒光成像性能進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示此納米材料在體外具有明顯的磁共振成像效果，縱向弛豫率為9.845 mM-1s-1，是臨床上常規(guī)使用的MRI對(duì)比劑釓噴酸葡胺的縱向弛豫率(4.49 mM-1s-1)的2.36倍[14]。在細(xì)胞層面，未經(jīng)此納米材料處理的腫瘤細(xì)胞未見明顯增強(qiáng)表現(xiàn)，而隨著與腫瘤細(xì)胞共同孵育的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液的濃度逐漸增高(50.0、100.0和200.0 mg/L)，腫瘤細(xì)胞沉積物在磁共振T1WI上信號(hào)強(qiáng)度逐漸增高。為了解較低濃度的納米診療劑可否實(shí)現(xiàn)細(xì)胞熒光成像，我們?cè)谘芯恐袑⒑胁煌珻e6濃度(0、4、8和16 mg/L)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液與人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231一起孵育，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，孵育細(xì)胞表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的紅色熒光，16 mg/mL濃度組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度可實(shí)現(xiàn)較好的熒光成像效果。根據(jù)負(fù)載量計(jì)算，Ce6的濃度為4、8和16 mg/L時(shí)對(duì)應(yīng)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的濃度分別為22.66、45.33和90.65 mg/L。由此可見，濃度為90.65 mg/L的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液對(duì)乳腺癌細(xì)胞即可具有良好的熒光成像能力。對(duì)乳腺癌荷瘤裸鼠的在體MRI和熒光成像結(jié)果顯示，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs可實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌的雙模態(tài)成像。此外，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs中的Gd離子在荷瘤裸鼠血液內(nèi)的半衰期約為2.03 h，與臨床常用的磁共振對(duì)比劑釓噴酸葡胺相比，半衰期明顯增加，為實(shí)現(xiàn)光熱治療作用提供了基礎(chǔ)[15-16]。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs表現(xiàn)出良好的升溫效果。將1.0 mL的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液(200 mg/L)經(jīng)尾靜脈注入荷瘤裸鼠體內(nèi)，注射2 h后對(duì)腫瘤組織使用808 nm激光輻照(1.5W/cm2)10 min，腫瘤組織的局部溫度可升高至51.5℃，顯著高于光熱消融腫瘤的溫度標(biāo)準(zhǔn)(43℃)。此外，經(jīng)該濃度的納米材料處理的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，相較于無激光輻照組，激光輻照組中的細(xì)胞存活率更低。乳腺癌荷瘤裸鼠的在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明MSN-Ce6@PDA-Gd NPs可實(shí)現(xiàn)有效的腫瘤治療效果。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了基于介孔硅-聚多巴胺的核殼結(jié)構(gòu)的納米診療劑MSN-Ce6@PDA-Gd NPs，其具有磁共振和熒光雙模態(tài)成像效果及光熱治療乳腺癌的效用，為實(shí)現(xiàn)乳腺癌的診療提供了新思路。

(利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突)。