夏偉偉 鄧竹根 戴祖云 韋小飛 李曼

摘? ? 要：為明確安徽省合肥市長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌種類及其生理小種，于2020年春季在長豐縣吳山鎮(zhèn)、水湖鎮(zhèn)、崗集鎮(zhèn)、造甲鄉(xiāng)等地采集16份白粉病病原菌。通過觀察病原菌的形態(tài)，并以長豐縣吳山地區(qū)的白粉病菌總DNA為模板擴增其rDNA內轉錄間隔區(qū)（ITS）序列，經過測序比對，推斷其為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。最后采用國際公認的13個甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主進行接種，根據抗感反應，確定長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌生理小種為Podosphaera xanthii race 1。初步明確了2020年春季合肥長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌的生理小種，為下一步該地區(qū)南瓜抗白粉病新品種選育奠定了基礎。

關鍵詞：南瓜;白粉病菌;生理小種;鑒定

中圖分類號：S642.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）11-024-06

Identification of physiological race of pumpkin powdery mildew in Changfeng region

XIA Weiwei1， DNEG Zhugen1， DAI Zuyun1，2， WEI Xiaofei1， LI Man2

（1. Anhui Jianghuai Hortriculture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China; 2. Anhui Agricultural University， Hefei 230036， Anhui， China）

Abstract： In order to verify the species and physiological races of pumpkin powdery mildew in Changfeng region， Hefei City， Anhui Province. In the spring of 2020， a total of 16 powdery mildew pathogens were collected in Wushan， Shuihu， Gangji， and Zaojia in Changfeng region. Through morphological observation， and using powdery mildew DNA from Wushan area of Changfeng region as a total DNA template to amplify its rDNA internal transcribed spacer （ITS） sequence. After sequencing and comparison， it was inferred to confirm that it was Podosphaera xanthii. Then the 13 internationally recognized? race differenciation host were used to identify the races. Based on the resistance to susceptibility， Podosphaera xanthii physiology race 1 was determined as the pathogenic physiology race of pumpkin powdery mildew in Changfeng region on the spring of 2020. In this study， we had identified the physiological races of powdery mildew pathogen of pumpkin in Changfeng area of Hefei in the spring of 2020， which laid a foundation for breeding new varieties of pumpkin resistant to powdery mildew in this area.

Key words： Pumpkin; Powdery mildew; Physiological race; Identification

南瓜屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）一年生蔓生草本植物，營養(yǎng)豐富，具有藥用和食用價值[1]。南瓜原產于墨西哥到中美洲一帶，明代傳入中國，并被廣泛種植。南瓜在生長周期內易受多種病害侵染，白粉病是主要病害之一。白粉病在南瓜生長中后期發(fā)病，后期植株葉片布滿白粉病病菌孢子，形成一層厚厚的白粉層，嚴重阻礙植物進行光合作用，導致果實減產、品質下降[2-4]。

瓜類白粉病病原菌主要有3個屬6個種：白粉菌屬（Erysiphe）、內絲白粉菌屬（Leveillula）及單囊殼屬（Podosphaera），6個種分別是白粉菌屬4個，為E. cichoracearum、E. communis、E. polygoni和E. polyphaga;內絲白粉菌屬1個，為L. taurica;單囊殼屬1個，為 P. xanthii [5]。其中對P. xanthii研究最多，已發(fā)現其有11個生理小種，分別是生理小種 0、1、2 US、2 France、3、4、5、N1、N2、N3和N4[6]。

白粉病病原菌主要是通過形態(tài)觀察、ITS rDNA序列分析及鑒別寄主抗感反應的方法進行鑒定。張怡等[7]利用形態(tài)觀察及 ITS rDNA 序列分析方法鑒定河南省周口市和商丘市的瓜類白粉病病原菌，結果表明白粉病病原菌均為Podosphaera xanthii。肖仲久等[8]利用同樣的方法對貴州省貴陽市、遵義市、六盤水市以及安順市南瓜白粉病菌進行鑒定，結果表明，白粉病病原菌均為 Podosphaera xanthii 。李蘋芳、蘇瑞、劉東順等[9-10]采用國際通用13個甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主對不同地區(qū)的白粉病菌進行鑒定，確定江浙滬和新疆地區(qū)生理小種分別為race1、race5，甘肅地區(qū)白粉病生理小種為2 Frace和N2。屈淑平等[1]通過形態(tài)觀察、ITS rDNA序列分析方法及甜瓜生理小種鑒別體系抗感反應表現，鑒定出黑龍江地區(qū)白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii），生理小種為2 France。

近幾年來，由于南瓜的經濟效益逐年提高，特別是西洋板栗小南瓜口感、風味及營養(yǎng)價值高等特點，加上政府財政支持，長豐縣種植面積達到667 hm2。為調查長豐地區(qū)侵染南瓜白粉病病原菌種類及生理小種，筆者通過對長豐地區(qū)白粉病病原菌形態(tài)結構觀察、分析白粉病病原菌ITS序列，同時采用國際通用的13個甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主試驗，以確定長豐地區(qū)病原菌種類及其生理小種，為該地區(qū)南瓜抗白粉病新品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

采用國際通用鑒別寄主：Iran H、Top mark、Vedran-tais、PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI 414723、MR1、PI 124111、PI 124112、PMR6、Nantais 和Oblong，由淮北師范大學、武漢市農業(yè)科學院和東北農業(yè)大學惠贈。白粉病寄主選用易感病南瓜自交系5802，由安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司提供。南瓜自交系5802于2020年春季種植在合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)江淮園藝農業(yè)示范園，用于病原菌分離與鑒定。甜瓜鑒別寄主于2020年秋季種植于合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)江淮園藝農業(yè)示范園大棚。甜瓜鑒別寄主白粉病的抗感反應見表1。

于2020年春季在長豐縣吳山鎮(zhèn)、水湖鎮(zhèn)、崗集鎮(zhèn)和造甲鄉(xiāng)等地采集16份自然發(fā)病的南瓜植株葉片。

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌分離純化 參照屈淑平等[1]的方法，將2020年6月中旬收集的白粉病菌分離純化，將純化后的單菌落置于吐溫-20溶液中，制成濃度為2.5×105～5.0×105個·mL-1孢子懸浮液，通過噴霧法對生長至2片真葉的健康南瓜幼苗進行接種，置于28 ℃、濕度80%環(huán)境中培養(yǎng)，經4次分離純化后利用易感病南瓜植株擴繁，活體保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.2 白粉病病原菌形態(tài)觀察 參照王佩鈴等[11]、梁巧蘭等[12]方法，觀察白粉病病菌分生孢子特征。

1.2.3 致病性檢測 按照科赫氏法則檢驗白粉病病原菌致病性。參照屈淑平等[1]的方法，取分離純化后南瓜葉片白粉菌于吐溫-20溶液中，制成2.5×105～5.0×105個·mL-1孢子懸浮液。種植30株南瓜幼苗。當植株長至2片真葉時，取15株幼苗噴施孢子懸浮液于南瓜葉片上，15株幼苗噴施滴加吐溫-20的無菌水溶液作對照。置于28 ℃、濕度80%環(huán)境中培養(yǎng)，觀察植株發(fā)病情況。

1.2.4 白粉病病原菌分子鑒定 南瓜白粉病病原菌總DNA提取采用天根植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）。以南瓜白粉病病原菌總DNA為模板，利用真菌核糖體ITS區(qū)段通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行PCR擴增。PCR 體 系 為 20 μL：10× Buffer 2 μL，dNTP 0.2 μL，上下游引物各1.0 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 14.6 μL，DNA模板1.0 μL。反應條件為：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共32個循環(huán)。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行純化。把純化的PCR產物送上海英濰捷基生物公司測序。將南瓜白粉病病原菌ITS序列在NCBI核酸數據庫進行比對，利用軟件Lasergene進行序列處理、分析。采用MegAlign方法進行多序列比對并構建系統發(fā)育樹。

1.2.5 白粉病病原菌生理小種鑒定 甜瓜白粉病病原菌13個鑒別寄主分別播種于12 cm×12 cm塑料花盆中，在4葉1心期進行噴霧接種，接種濃度為105個·mL-1，每個材料接10株苗，3次重復。接種后放置于長1.5 m、寬0.4 m、高1.8 m的2層不銹鋼架內，架子四周與頂部用塑料薄膜封閉，架子置于組培室內。使用空調及加濕器，控制溫度28 ℃、濕度80%，接菌 15 d 后觀察鑒別寄主發(fā)病情況。鑒定標準見表1，病情指數（DI）計算參照文獻[1]見表2。

病情指數（DI）計算如下：DI=Σ（sini）·（5N）-1·100。式中，si為發(fā)病等級，ni為相應發(fā)病等級植株數目，N為調查總株數觀測量。0

1.3 室內分子鑒定及小種鑒定

白粉病病原菌分離純化、形態(tài)觀察、分子及小種鑒定試驗于2020年6—8月在安徽省合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)橋沖村江淮園藝示范園分子實驗室進行。

2 結果與分析

2.1 南瓜白粉病病原菌的形態(tài)鑒別

將采集的16份南瓜白粉病病原菌分別進行顯微觀察，結果顯示，視野下不同來源的白粉菌分生孢子均呈廣橢圓形，內含多個纖維狀體，且串生成念珠狀，其分生隔膜有2～4個（圖1）。可初步判定，16份南瓜白粉病菌都是單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.2 病原菌致病性檢測

將長豐吳山地區(qū)的白粉病病原菌分離純化，純化后白粉病病原菌制作成懸浮液，采用噴霧接種法接種于5802南瓜幼苗葉片上。15 d后南瓜葉片表面出現小的圓形白色粉狀斑點，25 d后植株葉片白粉斑點擴散變大直至布滿整個南瓜葉片，發(fā)病狀態(tài)與自然發(fā)病情況相似（圖2）。再次觀察白粉病病原菌形態(tài)，發(fā)現其分生孢子、纖維狀體等形態(tài)特征與自然發(fā)病植株表現一致。結果表明，長豐吳山地區(qū)純化的白粉菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。其余3個地區(qū)檢測方法一致，顯示均為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。鑒定結果表明，16份白粉病病原菌均為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.3 病原菌的分子檢測

以長豐吳山地區(qū)南瓜白粉菌總DNA為模板，用通用引物 ITS1、ITS4 進行擴增。經電泳可見一條約為564 bp的特異性條帶（圖3）。

該特異性條帶經純化測序，在NCBI上進行BLAST比對分析，同時運用軟件Lasergene MegAlign將序列與不同地區(qū)、不同作物的白粉菌序列進行比對，結果表明，該南瓜白粉菌序列與Podosphaera xanthii序列一致性高達95%，同源性較高（圖4）。運用軟件Lasergene MegAlign建立系統發(fā)育樹（圖5），結果發(fā)現，南瓜白粉菌ITS序列與長壽花單囊殼（Podosphaera xanthii-KB）、茄子單囊殼（Podosphaera xanthii-SM）、番茄單囊殼（Podosphaera xanthii-SL）等親緣關系較近。其余3個地區(qū)檢測方法一致，顯示均與Podosphaera xanthii序列一致性在95%～98%。結果表明，長豐地區(qū)的南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.4 南瓜白粉病病原菌生理小種的鑒別結果

采用孢子懸浮液噴霧法，將長豐吳山地區(qū)白粉病病原菌純化后接種于13個國際通用鑒別寄主葉片上，觀察分析寄主的抗感反應（表3）。觀察發(fā)現，鑒別寄主Iran H 、Top-mark、Vedrantais、 Nantais Oblong接種白粉菌15 d發(fā)病，出現肉眼可見近圓形粉狀斑點;25 d充分發(fā)病，整株植物葉片及莖干布滿白粉，感病嚴重。而寄主PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI 414723、MR1、PI 124111、PI 124112、PMR6均表現為抗病。鑒定結果表明，長豐吳山地區(qū)南瓜白粉病病原菌生理小種是Podosphaera xanthii中的race1（表1～2）。其余3個地區(qū)白粉病病原菌采用同樣鑒定方法，顯示南瓜白粉病病原菌生理小種均為Podosphaera xanthii中的race1。結果表明，長豐地區(qū)16份白粉病病原菌生理小種均為Podosphaera xanthii中的race1。

3 討論與結論

單囊殼白粉菌屬于白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）單囊殼屬（Podosphaera），其寄主廣泛[1]。白粉病病原菌可通過分生孢子和分生孢子梗進行形態(tài)學鑒定，根據分生孢子內是否含有纖維狀體判斷其是否為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）[1，13-14]。筆者觀察視野下不同來源的白粉菌分生孢子均呈廣橢圓形，內含多個纖維狀體，且串生成念珠狀，其分生隔膜有2～4個不等，判斷其均為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

rDNA內轉錄間隔區(qū)（ITS）序列分析廣泛應用于病原菌分類[15-16]，通過rDNA內轉錄間隔區(qū)（ITS）序列分析表明，本試驗中白粉菌與Podosphaera xanthii聚類在同一分支，結果進一步證明長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

筆者運用了形態(tài)學觀察、分子鑒定以及國際通用甜瓜白粉病菌生理小種鑒別方法對安徽合肥長豐地區(qū)2020年春季南瓜白粉病病原菌進行鑒定，確認其為單囊殼白粉菌的race1。白粉病病原菌生理小種多樣，而且分化速度快。同種作物不同時期生理小種不同[17-18]，同時露地和大棚生長環(huán)境的不同導致同種作物生理小種也不同[19]。因此，下一步要針對長豐地區(qū)南瓜不同種植環(huán)境、不同季節(jié)的白粉病病原菌進行監(jiān)測，以更好地掌握當地白粉病生理小種變化情況，為南瓜抗白粉病選育提供依據。

筆者通過多種方法初步確定了長豐地區(qū)南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌的race1，并沒有發(fā)現其他生理小種，為長豐地區(qū)南瓜抗白粉病選育及種質資源相關研究提供了依據。

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