王瑞敏，劉毅，李菲，賈躍進

1 山西中醫(yī)藥大學 山西太原 030024 2 山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 山西太原 030024

失眠癥（Insomnia Disorder，ID）是臨床常見病和多發(fā)病，2002年國際精神衛(wèi)生和神經(jīng)學基金會調查顯示，我國人群中有45.5%存在睡眠問題；并有調查表明睡眠不足與抑郁癥（DD）、肥胖、代謝紊亂、心臟病、精神健康問題和癡呆癥有關，且有更多的研究發(fā)現(xiàn)在睡眠不足的情況下免疫系統(tǒng)會遭受多種改變，根據(jù)調查約有10%～20%的人群會受其影響。[1-2]對于ID的治療，目前作為一線藥物的苯二氮卓類受體激動劑（BzRAs）缺乏長期療效的證據(jù)且與潛在的不良反應有關，因此并非理想手段。[3]相比之下，中醫(yī)藥治療疾病有效且安全性高，具有一定優(yōu)勢，因此挖掘中醫(yī)藥對ID的治療具有較大的意義。

賈躍進主任醫(yī)師是全國名老中醫(yī)工作室指導老師，從醫(yī)40余年，對ID、DD等腦病治療有獨到的見解并有豐富的臨床經(jīng)驗。本文選取賈老近5年的門診病例，運用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡藥理學方法對其臨床用藥和處方特點進行歸納總結，并綜合分析其作用機制，以圖為ID的治療及相關研究提供一定思路與 參考。

資料與方法

1 入組標準

1.1 納入標準 根據(jù)《中國成人失眠診斷與治療指南》[4]診斷明確并單獨使用山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供的中藥顆粒劑治療，且安全、有效的病案。

1.2 排除標準 診斷、效果或安全性不明確的病案；合并其他影響判斷的精神及軀體疾病的病案；治療手段非單獨使用上述中藥顆粒劑的病案。

2 數(shù)據(jù)挖掘

2.1 數(shù)據(jù)收集 收集2015年7月1日-2020年7月1日間賈躍進名老中醫(yī)在山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院治未病中心門診收治的ID病案。

2.2 數(shù)據(jù)錄入與挖掘 根據(jù)納入和排除標準篩選后，以雙人雙錄入法將病案錄入至古今醫(yī)案云平臺V2.2.3中，然后結合2015版中國藥典[5]與第七版中藥學教材[6]對中藥進行名稱規(guī)范，如：“炒麥芽”統(tǒng)一為“麥芽”、“清半夏”統(tǒng)一為“半夏”。將所獲得的醫(yī)案使用數(shù)據(jù)挖掘模塊對其進行藥物頻次、屬性統(tǒng)計以及關聯(lián)、聚類和復雜網(wǎng)絡分析，并得出核心藥組。

3 網(wǎng)絡藥理學

3.1 核心藥組藥物活性成分及相關靶點獲取 利用CNKI（https：//www.cnki.net/）中 的 相 關 文 獻 及TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中檢索核心藥組各藥物活性成分，將所得活性成分在SwissADME（http：//www.swissadme.ch/）平臺中限定胃腸道吸收（GI absorption）、血腦屏障滲透（BBB permeant）、類藥性（Druglikeness）進行篩選，將篩選出的活性成分導入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）得出相關靶點，并匹配Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中的GeneSymbol。

3.2 疾病靶點獲取 在Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/#）數(shù)據(jù)庫中分別檢索“insomnia disorder”，將所得ID相關靶點合并、去重，再利用Uniprot數(shù)據(jù)庫匹配GeneSymbol。

3.3 藥物-疾病交集靶點獲得 將3.1中所得各活性成分相關靶點與3.2中所得ID相關靶點利用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在線作圖平臺取交集，獲得核心藥組活性成分中直接與疾病相關的靶點。

3.4 疾病-組方-藥物-成分-靶點及蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建 以疾病、核心組方、藥物、藥物活性成分、相關靶點為節(jié)點，其相互關系為邊，在CytoscapeV3.8.0中構建網(wǎng)絡；并將1.2.3中的藥物-疾病交集靶點導入String（http：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，然后利用Cytoscape的MCODE插件將所得PPI進行聚類，從而獲得核心靶點。

3.5 GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

將3.3中所得交集靶點導入Cytoscape的BInGO、ClueGO插件分別進行GO生物過程、分子功能、細胞成分和KEGG通路富集分析。

4 關鍵活性成分與關鍵靶點分子對接分析

選取3.4疾病-組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡中節(jié)點度較大的活性成分與PPI網(wǎng)絡各聚類中節(jié)點度較大的關鍵靶點分別在Zinc（https：//zinc.docking.org/）、PDB（http：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中獲得其3D結構，并使用Autodock vina進行分子對接，將其中對接較好的組合進行展示。

結果

1 數(shù)據(jù)挖掘結果

1.1 藥物屬性及證候統(tǒng)計 共搜集到病案432例，根據(jù)納入、排除標準篩選，獲得驗案200例。該200例驗案包含方劑256首，涉及中藥154味，總應用頻次3447次，其中藥物應用百分比大于18%的有20味，其應用頻次和為2221次，約占總頻次64%，見表1。將256首方劑中154味藥物進行性味歸經(jīng)的分析，結果以雷達圖表示，見圖1、2，其中中藥藥性分布主要為：溫、平、寒、微寒；藥味主要為：甘、辛、苦；而藥物的歸經(jīng)主要歸：脾、肝經(jīng)。中醫(yī)證候多見于肝郁證、肝郁脾虛證、痰證，見圖3。

表1 藥物使用頻次及百分比

圖1 四氣五味歸經(jīng)頻次分布雷達圖 （左：四氣頻次分布；中：五味頻次分布；右：歸經(jīng)頻次分布）

圖2 藥物功效統(tǒng)計

圖3 中醫(yī)證候分布

圖4 物聚類分析

1.2 藥物關聯(lián)分析、聚類分析、復雜網(wǎng)絡分析及核心組方確定 將256首處方利用云平臺數(shù)據(jù)分析，首先將置信度設置≥0.7，支持度≥0.4，得到20組藥物關聯(lián)分析結果，并按照支持度降序排列，如表2；將2.1.1中應用頻率大于18%的20味中藥進行聚類分析，同時設置距離類型為歐氏距離，聚類方法為：最長距離法，可將其分為：C1：茯苓、半夏、陳皮；C2：龍骨、牡蠣、柴胡、黃芩；C3：白芍、白術、香附、川楝子、枳實、萊菔子；C4：合歡皮、麥芽、黨參、遠志、石菖蒲等4個聚類處方，見表4；最后設置節(jié)點度不小于95，進行中藥-中藥復雜網(wǎng)絡分析，得到一個由8味中藥組成的核心組合，見圖5。綜合以上得出最核心藥物組方為：陳皮、遠志、白術、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓。

圖5 藥物復雜網(wǎng)絡分析

表2 藥物關聯(lián)分析

2 網(wǎng)絡藥理學結果

2.1 核心組方活性成分和對應靶點 通過檢索CNKI與TCMSP數(shù)據(jù)庫，并結合SwissADME篩選與Swisstargetprediction預測靶點，篩選出陳皮、遠志、白術、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓有效成分各4、37、4、15、9、9、5、6種，其中重復成分6種；相關靶點分別為29、624、68、359、73、79、33、128個。經(jīng)過去重、排除后，總計獲得有效成分83種，相關靶點770個。見表3。

表3 核心藥物組成部分成分相關信息

2.2 疾病靶點獲取結果和藥物-疾病靶點交集結果 將GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到的ID相關靶點按照相關度大于中位數(shù)進行篩選與OMIM數(shù)據(jù)庫中所得的靶點，合并與去重，共計獲得ID疾病靶點994個。利用微生信平臺將2.1中求得的藥物靶點與1.2中求得的疾病靶點取交集，共獲得163個藥物與疾病直接相關的交集靶點，見圖6所示。

圖6 藥物-疾病交集基因

2.3 疾病-核心組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡 將數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件，構建ID-核心組方-中藥-有效成分-對應靶點網(wǎng)絡，見圖7。圖7包含861個節(jié)點，2868條邊。從該網(wǎng)絡可得節(jié)點度較大（Degree＞50）的有效成分有：F、YZ16、YZ14、HHP8、YZ12、YZ13、YZ10、YZ17、FL4、FL5、A、YZ20。在String中導入163個交集靶點構建PPI網(wǎng)絡，然后通過MCODE插件分析網(wǎng)絡并根據(jù)聚類和節(jié)點度得出PPI核心網(wǎng)絡，見圖8所示，然后選擇其中節(jié)點度值大（DC＞615）的靶點作為核心靶點，有：AKT1、VEGFA、MMP9、IL6、FOS、TNF、CREB1、ESR1、DRD2、SLC6A4。

圖7 疾病-核心組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡

圖8 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡

2.4 GO富集分析和KEGG富集分析結果 將2.3中的交集靶點導入BInGO，并設置信水平為0.01，進行GO富集分析，見圖9，可得GO生物過程主要包括：細胞過程、生物調節(jié)、信號過程、對刺激的反應、代謝過程等；GO分子功能則包括：結合、抗氧化活性、電子載體活性、分子傳導活性、通道調節(jié)等；而GO細胞成分以：細胞器成分、突觸成分、高分子結合物等為主。再將交集靶點導入ClueGO，設定p-value≤0.01，最小聚類為15，K-score為0.45進行KEGG通路富集分析，見圖10，其中主要有：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、HIF-1信號通路、細胞間隙連接、尼古丁成癮、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、前列腺癌等。然后以有效成分、靶點、通路分別為節(jié)點，其相互關系為邊構建網(wǎng)絡，以直觀描述三者聯(lián)系，見圖11，而通過分析該網(wǎng)絡可得節(jié)點度最大的通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，提示核心組方治療極可能通過此通路對失眠障礙產生作用，該通路具體作用見圖12。

圖9 GO富集分析氣泡圖

圖10 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖11 成分-通路-靶點網(wǎng)絡

圖12 神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路

3 分子對接結果

從關鍵靶點和關鍵成分分子對接結果來看，其對接分數(shù)大多≤-5.0 kcal·mol/mol，具體見表4，提示核心藥組中的關鍵成分和關鍵靶點多可穩(wěn)定結合，將對接結果最好的前5個組合使用Pymol進行可視化，見圖13。

圖13 分子對接構象圖

表4 分子對接結果

討論

1 賈師對“不寐”的認識

中醫(yī)學稱失眠為“不寐”“目不瞑”“不得眠”等；歷代醫(yī)家對失眠的病機闡述頗多，但總屬陽盛陰衰，陰陽失交，如《靈樞·口問》曰：“陽氣盡，陰氣盛，則目瞑；陰氣盡，而陽氣盛，則寤矣”、《醫(yī)效秘傳·不得眠》云：“夜以陰為主，陰氣盛則目閉而安臥，若陰虛為陽所勝，則終夜煩擾而不眠也”等，均記載了陰陽盛衰對失眠的影響。中醫(yī)對失眠的認識不止于病因病機，還對失眠的治療有理法方藥咸備的描述，如《傷寒論》中所說：“虛勞虛煩不得眠，酸棗仁湯主之”。而現(xiàn)代人多食肥甘厚味，缺乏鍛煉，精神緊張，導致氣機不暢，氣血運行失常，賈老認為失眠病機為“陽不入陰，陰陽失交”，在治療上尤其重視“調暢氣機、肝脾并治”，療效頗佳。

2 賈師治療的用藥規(guī)律

從數(shù)據(jù)分析結果來看，使用頻率最高的藥物為：陳皮、遠志、白術、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓。這些藥物具有鎮(zhèn)靜催眠、調節(jié)植物神經(jīng)系統(tǒng)、改善認知功能、神經(jīng)保護等神經(jīng)系統(tǒng)作用，另具有抗抑郁、抗炎、改善胃腸功能等作用。[7-14]從中藥藥性分布來看，主要為：溫、平、寒、微寒，其藥物的寒涼偏性不明顯。藥味主要為：甘、辛、苦；甘味具有補益、和中、調和藥性等作用，辛具有行氣、行血的作用，苦具有清泄火熱、泄降氣逆、燥濕、瀉火存陰的作用，且辛開苦降，調暢氣機，正適應失眠的治療。藥物的歸經(jīng)主要為歸脾、肝經(jīng)，中醫(yī)證候多見于肝郁證、肝郁脾虛證、痰證，這反映出賈老“從肝論治”失眠的觀點，另藥物的歸經(jīng)與中醫(yī)證候也體現(xiàn)了賈老強調的“理法方藥”一致，并注重“方證相應”。藥物關聯(lián)分析中篩選出的20對核心關聯(lián)組合均是陳皮、遠志、白術、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓八位藥物之間相互關聯(lián)。其中陳皮、半夏、茯苓為二陳湯的主要組成，其功效為燥濕化痰行氣；遠志和合歡皮以疏肝解郁安神；白術與茯苓健脾祛濕；麥芽有行氣健脾之功，既能疏解肝之郁滯，又能護衛(wèi)脾之正氣，為賈老常用之佐使藥；整體觀之，賈老治失眠，以行氣疏肝健脾為主，兼以化痰祛濕。在聚類分析的處方中：C1為燥濕化痰的二陳湯；C2為和解樞機的柴胡加龍骨牡蠣湯；C3、C4為益氣健脾、行氣化痰的香砂六君子湯；均為賈老堅持“方證對應”中的常用方劑。復雜網(wǎng)絡分析也是從此八位藥物中所獲的核心藥組。以上說明，從數(shù)據(jù)挖掘中可得賈老治療ID的核心組方為陳皮、遠志、白術、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓，從中可看出賈老以“調暢氣機、肝脾并治”論治失眠的觀點。

3 核心組方的網(wǎng)絡分析

根據(jù)藥物網(wǎng)絡構建，得出核心藥組發(fā)揮作用的12個關鍵活性成分，其中F為廣泛存在于植物中的生物類黃酮，具有多種生物活性，有動物實驗表明它可顯著增加非快速眼動睡眠，同時顯著減少快速眼動睡眠；[15]YZ12、YZ13、YZ14、YZ20為遠志中的呫噸酮類，有研究表明此類物質可通過上調Nrf2表達來賦予神經(jīng)保護作用[16]；YZ17的3，4，5-三甲氧基肉桂酸甲酯（MTC）是具有生物活性的天然苯基丙烷，具有抗炎和抗氧化的作用，可以改善炎性所致的失眠癥狀[17]；HHP8為合歡皮中的木脂素類成分，該物質可能是合歡皮傳統(tǒng)安神作用的主要有效成分之一[18]；FL4、FL5是茯苓中的三萜化合物，有研究證明具有鎮(zhèn)靜興奮性神經(jīng)元和抗驚厥等作用。[19]

根據(jù)PPI網(wǎng)絡，所得的核心靶點中TNF在睡眠中的作用涉及與全身性TNF慢性升高和睡眠中斷有關的病理狀況，TNF參與了廣泛的緊密協(xié)調的生化網(wǎng)絡中的睡眠調節(jié)。[20]研究表明較低的睡眠效率與較高的IL-6循環(huán)水平相關，睡眠障礙與炎癥水平升高有關。[21]c-Fos是FOS中的一個因子，但c-Fos標記的睡眠活動神經(jīng)元的藥理學活化已顯示可誘導睡眠；還有研究表明在內側視前區(qū)中c-fos的表達與睡眠調節(jié)有因果關系，c-Fos在大腦皮層和海馬體的表達可能與長時間的清醒和睡眠需求有關。[22-23]VEGFA是VEGF生長因子家族的成員，在調節(jié)情緒狀態(tài)中起作用，而失眠與抑郁癥呈復雜的雙向關系。[24-25]在實驗中發(fā)現(xiàn)睡眠受限后，AKT的表達水平顯著降低，AKT的改變可能與慢性睡眠受限有關。[26]CREB1作為一種重要的調控蛋白質，其轉錄增加與睡眠階段的記憶形成有關。[27]ESR1即雌激素受體1，雌二醇通過其對ESR1和非經(jīng)典信號通路的作用來改變每日和晝夜節(jié)律。[28]多巴胺D2受體基因（DRD2）中的SNP（rs17601612）與睡眠時間顯著相關，研究證明第二個DRD2信號對睡眠時間有相反的影響[29]。

目前ID的病理機制尚不明確，但比較公認的有：細胞機制障礙、生物調節(jié)異常、神經(jīng)遞質系統(tǒng)紊亂（5-羥色胺、褪黑激素、y-氨基丁酸）、信號傳導障礙（下丘腦-垂體-腎上腺軸，即HPA軸）、代謝異常（葡萄糖、荷爾蒙、食欲素、瘦素等代謝異常）、遺傳基因等。[30-33]由GO富集分析得到的主要生物過程對ID公認病理機制幾乎都有涉及，可見核心組方參與多種機制，可從多個途徑對ID發(fā)揮治療作用。KEGG通路分析主要結果中：血清素能神經(jīng)傳遞都與睡眠-覺醒周期的控制有關，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT（血清素能）系統(tǒng)在控制疼痛，情緒，喚醒，睡眠-覺醒周期，學習/記憶，焦慮和獎勵行為方面起著至關重要的作用；[34-35]細胞間隙連接，如星形膠質細胞通過間隙連接介導的星形膠質網(wǎng)絡產生并向神經(jīng)元提供代謝底物的研究，證明了星形膠質網(wǎng)絡的擾動會損害睡眠-覺醒周期；[36]研究結果表明，早期蘇醒可能是尼古丁成癮嚴重程度與睡眠時間短和白天過度嗜睡的不良睡眠結果之間聯(lián)系的機制，尼古丁成癮的嚴重性是影響睡眠質量的重要因素，而不僅僅是吸煙狀態(tài)，較高的成癮水平導致較少的睡眠和更多的白天嗜睡[37]。

分子對接結果表明，關鍵有效成分和關鍵靶點大多都結合成穩(wěn)定結構，而其與各關鍵成分對接較好的靶點為AKT1、DRD2和ESR1，與關鍵靶點對接較好的成分是YZ14（1，7-二甲氧基-2，3-亞甲二氧基呫噸酮）和FL5（去氫齒孔酸），這提示核心組方可能由這兩種成分作用于以上的三個靶點從而發(fā)揮治療ID的作用。

綜上所述，通過數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡藥理學和分子對接研究，可以得到賈老中藥治療ID的核心組方：陳皮、遠志、白術、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓，并初步揭示其多成分、多靶點、多通路作用機制，所涉及的關鍵成分為：1，7-二甲氧基-2，3-亞甲二氧基呫噸酮、去氫齒孔酸；核心靶點為：AKT1、DRD2和ESR1；主要通路為：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、細胞間隙連接。該結論可為進一步研究和臨床應用提供參考。