南芳茹 李 娟 劉旭東 馮 佳 劉 琪 呂俊平 謝樹蓮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006)

胭脂藻屬(HildenbrandiaNardo)隸屬紅藻門Rhodophyta, 真紅藻綱Florideophyceae, 胭脂藻目Hildenbrandiales, 胭脂藻科Hildenbrandiaceae, 藻體桔紅色或暗紫色, 軟骨質(zhì)狀, 匍匐呈扁平皮殼狀, 由基層細胞和直立細胞組成[1]。該屬在海洋和淡水水體中均可生長, 二者形態(tài)特征相似, 但生殖方式不同, 胭脂藻海洋類群的生殖方式為四分孢子囊(Tetrasporangia), 淡水類群的生殖方式為藻體的斷裂和孢芽(Gemmae)[2]。胭脂藻屬海洋類群在潮間帶和潮下帶區(qū)域廣泛分布[3,4], 而淡水產(chǎn)胭脂藻對生境條件要求苛刻, 地理分布十分有限, 已有國家將其列為瀕危物種[5,6]。該屬植物形態(tài)特征較為簡單,但卻是淡水紅藻中起源較早、進化地位較為高級的類群之一。

胭脂藻屬(Hildenbrandia)最初由納爾多(Nardo)于1834年在意大利發(fā)現(xiàn)并建立, 此后陸續(xù)報道了該屬在北美洲、亞洲和歐洲等地的分布[7,8]。目前Algaebase已收錄的分類單位近50個, 只包含了6個淡水種類, 分別為河生胭脂藻Hildenbrandia rivularis(Liebmann) J. Agardh、Hildenbrandia angolensisWelwitsch ex West & G. S. West、Hildenbrandia arracanaZeller、Hildenbrandia ramanaginaeM.Khan、Hildenbrandia jigongshanensisNan & Xie和Hildenbrandia japananensisF. Nanet al.[9]。根據(jù)傳統(tǒng)的分類標準, 淡水胭脂藻種類的鑒定依據(jù)包括細胞大小、藻體殼狀皮層的直徑和藻體厚度, 其中細胞大小和藻體高度是2個主要的分類特征, 而這些形態(tài)特征在不同的環(huán)境條件下是可變的, 受環(huán)境因素的影響較大, 因而根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法對淡水胭脂藻進行種類分類鑒定十分困難[10,11]。隨著近年來分子生物學(xué)方法在淡水紅藻分類和系統(tǒng)演化研究中的廣泛應(yīng)用, 在胭脂藻屬的分類和起源研究中也加入了越來越多的分子證據(jù)?；趓bcL、18S rDNA等分子數(shù)據(jù)的支持, 建立了2個新種H. jigongshanensis和H. japananensis[12,13]?；趶谋泵乐薏杉臉吮? 利用rbcL和18S rDNA序列分析, 發(fā)現(xiàn)淡水種H. rivularis為單系類群, 而H. angolensis在系統(tǒng)樹中呈多系分布; 同時淡水胭脂藻與海洋類群呈多系關(guān)系, 推測淡水紅藻是由海洋種類向內(nèi)陸多次入侵而形成的[10,14]; 但基于從歐洲分布的胭脂藻標本構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹, 顯示淡水種是經(jīng)過單次的海水種入侵形成的[15]。由此可見, 海產(chǎn)、淡水產(chǎn)胭脂藻種群的關(guān)系依然不明確, 需要更多分子數(shù)據(jù)進行深入研究。

淡水胭脂藻的地理分布具有一定的區(qū)域特征,歐洲分部的淡水種主要是H. rivularis[10], 北美洲分布的淡水種主要是H. angolensis[14]。目前H. ramanaginaii為印度特有種[16], 而H. arracana只報道于緬甸[17]。2003年, Sherwood和Sheath綜合形態(tài)和分子系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建, 對采集到的48個胭脂藻屬標本進行分析, 根據(jù)形態(tài)特征歸類, 將淡水胭脂藻種類分為2組, 分別對應(yīng)北美、菲律賓分布和歐洲、卡納里分布的樣本[11]。另外2個淡水胭脂藻種類H. jigongshanensis為中國特有種,H. japananensis只分布于模式標本產(chǎn)地[12,13]。目前中國報道的淡水胭脂藻有2種, 河生胭脂藻H. rivularis分布地有山西、福建、湖北和西藏[1]; 雞公山胭脂藻H. jigongshanensis分布地有山西和河南[12,13]。需要借助分子數(shù)據(jù)深入研究淡水胭脂藻的現(xiàn)代地理分布格局和祖先地理起源。

本研究基于從中國云南和河南新采集的2株胭脂藻標本, 對其進行了形態(tài)特征測量和目標基因序列測定, 綜合傳統(tǒng)形態(tài)特征和分子生物學(xué)證據(jù)對其進行了種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建, 同時結(jié)合目前已報道的胭脂藻地理分布信息, 對該屬植物進行了地理親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)生分析, 豐富了我國淡水胭脂藻的多樣性, 同時為胭脂藻屬植物的起源和進化提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗使用的胭脂藻藻株(編號: YZYUNNAN)于2019年4月16日采自云南省玉溪市新平彝族傣族自治縣曼卡路 (24.07N, 101.99E), 藻株編號YZHENAN于2019年8月28日采自河南省焦作市修武縣云臺山不老泉(35.47N, 113.34E)。使用刀片將附著在石頭表面的胭脂藻輕輕刮下, 再用無菌水將附著的雜質(zhì)清洗后, 一部分立即進行分子鑒定, 另一部分用4%的甲醛溶液進行固定后用作形態(tài)學(xué)觀察。

1.2 實驗方法

形態(tài)學(xué)觀察使用顯微鏡(BX-51, 奧林匹斯)對藻體進行觀察, 并用其附帶的相機(DP72, 奧林匹斯, 東京, 日本)進行圖像信息的采集。

總DNA的提取利用Saunders提出的DNA提取方法的改良版對采集的胭脂藻進行總DNA的提取[18]。

擴增目的基因及測序查閱文獻, 確定PCR體系及引物, YZHENAN藻株rbcL基因引物為HILF2和rbcLr, UPA基因引物為p23SrV-f1和p23SrV-r1; YZYUNNAN藻株rbcL引物為F650和rbcLr;psbA引物為psbAF和psbAR2[13,19,20]。PCR體系為20 μL: DNA模板0.5 μL, dNTPs 2 mL, 正向、反向引物各2 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL, 10×Buffer(Mg2+) 2 μL, 補充ddH2O至20 μL。擴增上述基因得到PCR產(chǎn)物后, 通過1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,20min)進行檢測。擴增產(chǎn)物送至華大基因公司進行檢測: 采用Sanger雙脫氧終止法進行雙向測序(華大基因公司, 北京)。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建在NCBI中運用blast工具將實驗中獲得的rbcL、psbA和UPA基因序列與GenBank已發(fā)表的有關(guān)序列進行在線比對后篩選出所需的基因序列。利用軟件BioEdit對所選序列進行比對并切除兩端不整齊的堿基[21], 在軟件MAGA7.0中對下載的序列及目的序列進行序列特征分析[22], 利用Modeltest ver. 3.7軟件計算分子序列集最優(yōu)進化模型[23]。分別使用MEGA7.0軟件構(gòu)建鄰接樹, PHYML軟件構(gòu)建最大似然樹, MrBayes ver. 3.1.2軟件構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹[22,24,25], 基于1000次重復(fù)計算得到鄰接樹和最大似然樹各節(jié)點的支持率, 貝葉斯后驗概率基于1000代抽樣并舍棄前25%計算獲得。在建樹結(jié)束后, 使用Figtree 1.4.2對各軟件的計算結(jié)果進行查看并編輯 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)。

地理起源分析GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的胭脂藻屬各地理分布的標本中, 只有rbcL序列信息比較充足, 選取該序列進行生物地理系統(tǒng)分析。對GenBank中獲得的rbcL序列的標本分布地進行統(tǒng)計, 按地理位置A-西太平洋東南亞島國、B-拉丁美洲、C-東加勒比海、D-歐洲、E-北美洲和F-亞洲進行分類, 結(jié)合貝葉斯系統(tǒng)樹結(jié)果, 利用RASP軟件構(gòu)建近源物種祖先地理分布圖[26]。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察結(jié)果

采自河南焦作市的胭脂藻標本(YZHENAN)和采自云南玉溪市的胭脂藻標本(YZYUNNAN)形態(tài)觀察結(jié)果分別為圖 1和圖 2。藻體外形為薄皮殼狀,顏色呈紫紅色, 附著在水流中的石塊表面生長。靠近藻體的中部顏色較深, 為深紫紅色, 藻體邊緣區(qū)域顏色逐漸變淡。基部細胞單層, 直立細胞多層,形成整齊致密的分枝。藻體高度分別為42—50 μm,細胞直徑分別為(5.0—8.0) μm×(4.0—6.7) μm和(4.8—8.0) μm×(4.8—6.4) μm, 細胞近四方形, 片狀色素體周生。

圖1 采自河南焦作市的胭脂藻標本(YZHENAN)形態(tài)顯微照片F(xiàn)ig. 1 Morphological structures of specimen collected from Jiaozuo City, Henan Province, China (YZHENAN)

圖2 采自云南玉溪的胭脂藻標本(YZYUNNAN)形態(tài)顯微照片F(xiàn)ig. 2 Morphological structures of specimen collected from Yuxi City, Yunnan Province, China (YZYUNNAN)

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

序列特征分析所采集的標本所測序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中?；趓bcL序列計算結(jié)果, 所采標本YZHENAN、YZYUNNAN與H. jigongshanensis其他標本的遺傳距離為0.001, 與其他淡水胭脂藻種類的遺傳距離為0.005—0.127(與H.japananense的遺傳距離為0.005, 與H. rivularis的遺傳距離為0.033, 與H. angolensis的遺傳距離為0.127); 本研究測得一株采自云南的胭脂藻標本(YZYUNNAN)psbA序列, 基于psbA序列計算結(jié)果,該標本與另外一株H. jigongshanensis標本的遺傳距離為0.001, 與H. rivularis的遺傳距離為0.086; 基于本研究中測得的采自河南的胭脂藻標本(YZHENAN)的UPA序列, 所采標本YZHENAN與另外1株H.jigongshanensis標本的遺傳距離為0.023, 與H. angolensis的遺傳距離為0.082, 與H. rivularis的遺傳距離為0.080。各序列經(jīng)過Modeltest軟件分析得到的最佳進化模型及相關(guān)的模型參數(shù)列于表 1。

表1 Modeltest 3.7分析獲得的rbcL、psbA和UPA基因模型及相關(guān)參數(shù)Tab. 1 Nucleotide substitution model parameter estimates of rbcL, psbA and UPA gene for Modeltest 3.7 analyses

基于rbcL、psbA和UPA基因的系統(tǒng)進化分析基于rbcL基因數(shù)據(jù)集, 以采集到的2株胭脂藻YZHENAN和YZYUNNAN, 以及GenBank下載的胭脂藻科的28株胭脂藻標本作為研究對象, 以紅索藻屬Thorea為外類群, 采用鄰接法, 最大似然法和貝葉斯法三種方法構(gòu)建得到的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)一致, 因此將最大似然法得到的系統(tǒng)樹作為基準, 把3種方法所得到的支持率標注在對應(yīng)的節(jié)點,得到最終的系統(tǒng)發(fā)育樹?；趓bcL基因的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖 3), 本研究中的標本YZHENAN、YZYUNNAN與其他5株雞公山胭脂藻H. jigongshanensis標本聚為一支, 支持率為73.9/0.76/85, 日本胭脂藻H. japananense位于雞公山胭脂藻形成的分支基部。河生胭脂藻H. rivularis所有標本聚為一個單系分支, 支持率為70.5/0.75/88。雞公山胭脂藻H. jigongshanensis、日本胭脂藻H. japananense和河生胭脂藻H. rivularis聚類為一個大分支, 但支持率較低, 采自哥斯達黎加的2株安哥拉胭脂藻H. angolensis標本(AF107816和AF107817)形成的姐妹支位于該分支基部, 得到了很高的支持率(98.9/0.97/100)。安哥拉胭脂藻H. angolensis在系統(tǒng)樹中形成多系分布, 但都位于其他3種淡水胭脂藻的基部位置, 淡水胭脂藻全部標本, 包括4個種類(雞公山胭脂藻H. jigongshanensis、日本胭脂藻H. japananense、河生胭脂藻H. rivularis和安哥拉胭脂藻H. angolensis)形成一個單系分支, 但只得到了貝葉斯方法的支持度為90%。海水胭脂藻H. rubra和H. crouanii位于整個系統(tǒng)樹的基部位置, 其中H. rubra形成多個分支。

圖3 基于rbcL基因序列的系統(tǒng)樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on rbcL gene sequence

基于psbA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 4所示, Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中關(guān)于胭脂藻該序列的信息較少, 只有1株淡水標本(KX284723)和1株海水標本(DQ787633)的序列信息。本研究測得一株標本YZYUNNAN的psbA基因序列, 其與采自河南雞公山的雞公山胭脂藻H. jigongshanensis標本聚類形成姐妹支, 并得到了很高的支持率, 3種方法的支持率均為100%。河生胭脂藻H. rivularis與雞公山胭脂藻H. jigongshanensis分支聚類, 也得到了較高的支持率(93.7/1.00/98)。海水胭脂藻H. rubra與胭脂藻科的另一個屬Apoph-laea聚為一支, 支持率為90.2/1.00/65?；赨PA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 5所示, 目前胭脂藻屬在Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中有3株淡水標本(EF426600、KM 676587和KX284723)和4株海水標本(HQ421668、HQ421389、HQ421105和KX284724)的序列信息,本研究所測標本YZHENAN與雞公山胭脂藻H. jigongshanensis聚為姐妹支, 3種方法的支持率均為100%。雞公山胭脂藻H. jigongshanensis分支與2株安哥拉胭脂藻H. angolensis標本形成的姐妹支聚類,基部為河生胭脂藻H. rivularis, 共同形成一個單系分支。4株海水胭脂藻H. rubra標本與胭脂藻科的另一個屬Apophlaea聚類。以紅藻屬Bangiopsis為外類群, 3株紫球藻標本形成的分枝位于系統(tǒng)樹基部, 其他胭脂藻科的所有類群聚為一個單系分支,得到了3種方法100%的支持率。

圖4 基于psbA基因序列的系統(tǒng)樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on psbA gene sequence

圖5 基于UPA基因序列的系統(tǒng)樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on UPA gene sequence

基于可靠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和各個標本的現(xiàn)代地理分布信息, 得到胭脂藻屬植物的祖先地理分布圖(圖 6)。目前所有雞公山胭脂藻H. jigongshanensis標本的分布地均為中國,H. japananense的分布地僅在日本, 河生胭脂藻H. rivularis的分布地主要在歐洲, 安哥拉胭脂藻H. angolensis的分布地比較廣泛, 包括西太平洋東南亞島國、拉丁美洲和東加勒比海區(qū)域和北美洲。通過祖先地理分布區(qū)重建,淡水胭脂藻的祖先地理分布地追溯至北美洲(節(jié)點59), 且得到100%的支持。雞公山胭脂藻H. jigongshanensis各標本的聚類關(guān)系中, 采自河南的4株標本(KU573962、KU573963、KU573964和YZHENAN)聚為一枝, 而采自云南的YZYUNNAN與采自山西的MN905125聚為一枝, 采自山西的另一株標本MN905126形成獨立的分枝。

圖6 基于rbcL序列的胭脂藻屬祖先地理分布圖Fig. 6 Reconstruction of ancestral geographical distribution of genus Hildenbrandia based on rbcL gene sequence

3 討論

rbcL序列已廣泛用于淡水胭脂藻屬的分子生物學(xué)研究中, 而psbA和UPA序列也在其他淡水紅藻的系統(tǒng)分類研究中比較常見, 它們都包含有較多的系統(tǒng)發(fā)育信號, 能夠被用于進行種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)生分析[13,27,28]。基于rbcL序列的計算結(jié)果, 河生胭脂藻H. rivularis的種間遺傳距離為0—1.9%[10]。而本研究中YZHENAN、YZYUNNAN與H. jigongshanensis的rbcL序列遺傳距離為0.1%, 介于種間遺傳差異范圍內(nèi), 該差異也遠小于YZHENAN、YZYUNNAN與其他淡水胭脂藻種類的遺傳距離,同時基于3個基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明,YZHENAN、YZYUNNAN與雞公山胭脂藻H. jigongshanensis的標本聚合為一個獨立分枝, 并得到了很高的支持率, 根據(jù)分子生物學(xué)證據(jù), 可以將YZHENAN和YZYUNNAN定種為雞公山胭脂藻H.jigongshanensis。目前雞公山胭脂藻H. jigongshanensis為中國特有種, 其模式標本產(chǎn)地為河南省信陽市, 之后在山西省平定縣也報道了該種的分布[12,13],本研究中該種類的標本采集自云南省玉溪市和河南省焦作市, 拓寬了該中國特有種的地理分布范圍。

基于傳統(tǒng)形態(tài)特征和現(xiàn)代分子生物學(xué)證據(jù), 胭脂藻屬目前被接受的4個淡水種類的關(guān)鍵分類特征列于表 2, 其中日本胭脂藻與雞公山胭脂藻H. jigongshanensis的形態(tài)特征參數(shù)重疊, 主要依據(jù)分子生物學(xué)證據(jù)建立該種[13]。本研究中所采標本YZHENAN和YZYUNNAN藻體高度為42—50 μm,細胞直徑分別為(5.0—8.0)μm×(4.0—6.7)μm和(4.8—8.0)μm×(4.8—6.4)μm, 與河生胭脂藻的形態(tài)參數(shù)是相吻合的, 但分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示它們之間存在很大的遺傳差異, 包含YZHENAN和YZYUNNAN的雞公山胭脂藻與河生胭脂藻各自形成獨立的分枝, 本研究對YZHENAN和YZYUNNAN的定種主要依據(jù)分子生物學(xué)證據(jù), 與傳統(tǒng)的形態(tài)特征分類存在不一致。隨著分子系統(tǒng)發(fā)育分析的普遍應(yīng)用, 淡水紅藻中利用分子生物學(xué)證據(jù)進行種類鑒定, 從而否定了一些傳統(tǒng)形態(tài)分類特征的可靠性[20,29,30]。通過本研究中所采集2株雞公山胭脂藻的形態(tài)特征比較, 發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)形態(tài)分類特征包括藻體高度和細胞直徑, 在不同的環(huán)境條件下是可變的, 不適合作為胭脂藻屬植物種類鑒定的依據(jù)。對于胭脂藻屬這一形態(tài)結(jié)構(gòu)較為簡單的類群, 借助分子生物學(xué)證據(jù)和系統(tǒng)發(fā)育分析手段對其進行種類鑒定和親緣關(guān)系重建是必要的。

表2 淡水胭脂藻種類的關(guān)鍵分類特征Tab. 2 Key taxonomic characters of freshwater Hildenbrandia

淡水胭脂藻的起源和系統(tǒng)演化研究方面, Sherwood和Sheath基于rbcL序列對北美洲和歐洲的胭脂藻屬植物進行了系統(tǒng)發(fā)育分析, 表明淡水胭脂藻種類H. rivularis形成一個單系分枝, 與海洋種類相分離, 且種間遺傳距離很小, 認為其是海洋種的單次入侵形成; 而H. angolensis與海水種類呈多系聚類的關(guān)系, 認為淡水的胭脂藻類群是經(jīng)過海洋種多次入侵形成的[11,14,15]。根據(jù)本研究中胭脂藻屬植物分子系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果, 支持河生胭脂藻H. rivularis是一個獨立的單系類群, 安哥拉胭脂藻H. angolensis是多系起源, 而雞公山胭脂藻H. jigongshanensis也是一個獨立的單系類群, 其與分布于日本的日本胭脂藻H. japananense親緣關(guān)系較近, 與其他2個淡水種H. rivularis和H. angolensis形成一個獨立的分枝, 但與海洋種類的遺傳差異較大?；?個基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 都表明淡水胭脂藻種類形成一個獨立的聚類群, 與海洋種類遺傳距離較遠,推測該類群是在內(nèi)陸水體中獨立起源和演化形成的。與之前淡水胭脂藻通過海洋近緣種入侵內(nèi)陸水體的起源推測不同, 本研究通過增加胭脂藻屬植物樣本取樣分析, 佐證了之前基于細胞器基因組系統(tǒng)演化的分析結(jié)果[11,14,31,32]。胭脂藻淡水與海洋類群營養(yǎng)細胞形態(tài)相似, 主要區(qū)別是生殖方式不同[2],這與紅藻門另一個屬紅毛菜屬Bangia是相似的, 但在紅毛菜分類體系中仍將海洋和淡水類群歸為同一屬[33], 因此我們建議依然保留胭脂藻屬現(xiàn)在的分類體系, 將海洋和淡水類群的遺傳距離歸屬為種間差異。

淡水胭脂藻具有明顯的地理分布特點, 根據(jù)報道,歐洲分布的淡水胭脂藻種類為H. rivularis, 北美的淡水胭脂藻種類主要為H. angolensis，H. jigongshanensis和H. japananense為中國和日本特有種[11,12—14]。胭脂藻目屬于紅藻綱中起源時間最早的一個譜系,在大約943百萬年前發(fā)生分化, 經(jīng)歷了較長的演化過程[34], 這可能是該屬植物各地理區(qū)域演化形成不同種類的原因之一。祖先地理重建的分析結(jié)果表明, 淡水胭脂藻的祖先起源地位于北美洲, 然后逐漸向東加勒比海區(qū)域、拉丁美洲和歐亞大陸擴散,經(jīng)過種群擴散和各地理分布區(qū)類群的獨立演化后,形成現(xiàn)代的種類地理分布模式。淡水胭脂藻在北美洲區(qū)域起源時間較早, 進化歷史漫長, 遺傳多樣性大, 這與該地理區(qū)域分布的種類H. angolensis為多系類群是相一致的。淡水紅藻的典型代表類群串珠藻目Batrachospermales, 其祖先起源地位于古地中海沿岸, 大洋洲和北美洲是兩個次級分布中心[35]。在紅藻的現(xiàn)代分類系統(tǒng)中, 胭脂藻屬隸屬于胭脂藻亞綱Hildenbrandiophycidae, 與串珠藻目植物隸屬2個不同的亞綱分類單元, 親緣關(guān)系較遠, 且屬于紅藻中起源比較古老的譜系[34], 因此二者的地理起源和分布擴散模型不同, 也進一步表明了淡水紅藻的古老起源和進化多樣性。