董曉琪 劉國祥 朱 歡

(1. 西藏大學(xué)理學(xué)院, 拉薩 850000; 2. 中國科學(xué)院藻類生物學(xué)重點實驗室, 武漢 430072; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

綠色植物界(Viridiplantae)是由綠藻門(Chlorophyta)和鏈形植物門(Streptophyta)組成的一類光合生物的統(tǒng)稱[1-6]。它主要由傳統(tǒng)意義上的低等綠藻(Green algae)和高等植物(Higher plants)組成, 后者通常又被稱之為有胚植物(Embryophyta)或陸生植物(Land plants)。根據(jù)Algaebase(https://www.algaebase.org/)和NCBI taxonomy(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/)兩個數(shù)據(jù)庫所采用的分類系統(tǒng), 這一定義中的綠藻(Green algae)分為兩大類群, 其一為傳統(tǒng)的綠藻門類群(即綠藻門, Chlorophyta), 它主要包括蔥綠藻(Prasinophytes)和核心綠藻(core Chlorophytes)兩個大類群; 其二為鏈形藻類(Streptophyta algae), 它主要包括廣義的輪藻門藻類(Charophytasensu lato), 即由輪藻綱(Charophyceae)、雙星藻綱(Zygnematophyceae)、鞘毛藻綱(Coleochaetophyceae)、克里藻綱(Klebsormidiophyceae)、綠方藻綱(Chlorokybophyceae)和中眼藻綱(Mesostigmatophyceae)六個類群的藻類組成。

被藻類學(xué)家廣為采納的綠藻分類系統(tǒng)逐漸脫離了依據(jù)形態(tài)特征所建立的框架, 并與基于鞭毛根系統(tǒng)(Flagellate root system)的超微結(jié)構(gòu)研究和分子系統(tǒng)發(fā)育研究所建立的分類框架趨于一致[5,7,8]。而在這一系列的研究進(jìn)程中, 蔥綠藻的分類與系統(tǒng)發(fā)育具有極為重要的意義。蔥綠藻的典型特征是原生質(zhì)體外多由酸性多糖質(zhì)的鱗片所包被, 且在光合作用產(chǎn)物、游動細(xì)胞形態(tài)上更為原始和多樣。越來越多的研究表明, 這一分類框架中的蔥綠藻為深度發(fā)生且高度并系的類群。蔥綠藻也被認(rèn)為是綠色植物中最古老的類群[9-11]。

中眼藻屬最早被描述于1894年[12], 是一種鞭毛器(Flagellate apparatus)具有多層結(jié)構(gòu)(Multi-layers structure, MLS)且有鱗包被的綠色藻類, 能產(chǎn)生并維持一個復(fù)雜的三層胞外基質(zhì), 由內(nèi)部菱形鱗片、中部橢圓形鱗片和外部籃狀鱗片三種類型的鱗片組成[13,14]。在蔥綠藻中, 中眼藻屬被描述為一個特殊的類群, 其多糖質(zhì)的鱗片與特殊的鞭毛位置使得藻類學(xué)家將其與其他蔥綠藻并列歸入綠藻門中。而基于鞭毛根系統(tǒng)的超微結(jié)構(gòu)研究支持中眼藻與輪藻和高等植物具有更近的親緣關(guān)系, 分子系統(tǒng)發(fā)育的研究則進(jìn)一步肯定了基于超微結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果[2]。近20年來絕大多數(shù)關(guān)于中眼藻的超微結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)研究證實其為鏈形植物的一個分支, 而不是處于綠藻門支系中[15—17]?；诩?xì)胞器基因組數(shù)據(jù)和全基因組數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究更進(jìn)一步支持中眼藻是鏈形植物門中最為原始的類群[18—20]。現(xiàn)在藻類學(xué)界普遍認(rèn)為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的單細(xì)胞鞭毛藻中, 中眼藻是與高等植物親緣關(guān)系最近的藻類[21]。

中眼藻主要分布于靜止的淡水水體中, 諸如池塘、水庫和小型湖泊等[22]。本研究對采自重慶合川和福建九龍江水庫的標(biāo)本進(jìn)行了形態(tài)觀察和分子系統(tǒng)發(fā)育分析, 描述了中眼藻的形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育位置; 同時以三峽水庫為例, 應(yīng)用環(huán)境DNA技術(shù)檢測了中眼藻在水庫中的時空分布情況。這是中眼藻屬在中國的首次報道。

1 材料與方法

1.1 材料采集與形態(tài)觀察

采集中眼藻樣品使用25號浮游生物網(wǎng), 采集后的標(biāo)本一部分用福爾馬林加10%的甘油固定用于形態(tài)觀察, 另一部分用無水乙醇固定用于DNA提取。樣品采集信息見表 1。環(huán)境DNA采集與樣品處理方法參見Hu等[23], 采集信息見表 2。形態(tài)觀察在光學(xué)顯微鏡(DM5000B: Leica, Wetzlar, Germany)下進(jìn)行, 由于中眼藻細(xì)胞較小, 使用油鏡(100×)對其進(jìn)行觀察; 利用Leica DFC320數(shù)碼相機(jī)對藻體形態(tài)特征、藻體顏色、長寬比例和藻體內(nèi)部結(jié)構(gòu)等具有辨識度的特征進(jìn)行拍攝。

表1 中眼藻標(biāo)本信息及GenBank登錄號Tab. 1 Sample time of the studied specimens and GenBank accession number

表2 環(huán)境DNA采集信息詳情Tab. 2 Details of environmental DNA collection

1.2 單細(xì)胞PCR擴(kuò)增及測序

模板DNA制備: 在倒置顯微鏡下確定目標(biāo)藻體, 用孔徑約0.1 mm的微吸管吸取單細(xì)胞直到提取出的細(xì)胞僅為中眼藻1種, 用移液槍吸取50 μL含有細(xì)胞的緩沖液(PBS)至PCR管中, 加入2 μL裂解緩沖液(Vazyme, Nanjing, China), 95 ℃熱處理15min, 處理后將獲取的DNA模板保存于-20 ℃冰箱中備用。

PCR擴(kuò)增體系共50 μL, 其中包含正反向引物各1.5 μL, 引物最終濃度為0.4 μmol/L; 4 μL模板DNA; 25 μL2×TaqMaster Mix(ExTaq, TaKaRa,Dalian, China); 無菌雙蒸水18 μL。18S rDNA擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件參照Honda等[24]。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳, 根據(jù)條帶長度切下目標(biāo)條帶, 凝膠回收試劑盒回收(E.Z.N.A. Gel Extraction Kit Omega Bio-Tek, America)并純化PCR產(chǎn)物后送至擎科生物公司測序(TSING KE, Wuhan, China), 測序后的序列上傳至GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。環(huán)境DNA的提取及測序方法參見Hu等[23]。環(huán)境DNA序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫, 其Bioproject Accession為PRJNA496371。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫對18S rDNA基因序列進(jìn)行BLAST相似性對比, 下載相似度高的序列片段,首先使用MAFFT 7.4對序列矩陣進(jìn)行比對[25], 然后使用MEGA 7.0軟件對序列進(jìn)行手動校正[26], 在DAMBE5.0中對數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評估[27]。使用ModelFinder軟件選擇最適模型[28]。采用最大似然法(Maximum likelihood, ML)和貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 最大似然法使用軟件為 RAxML 8.0[29], 貝葉斯法使用 MrBayes 3.2[30]。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察

中眼藻屬

Mesostigma Lauterborn 1894

Lauterborn, R. Ueber die Winterfauna einiger Gew?sser der Oberrheinebene. Mit Beschreibungen neuer Protozoen. Biologische Centralblatt, 1894, 14:390—398

Holotype species:Mesostigma virideLauterborn 1894

細(xì)胞扁平到鞍形, 從背側(cè)凹陷處伸出2條鞭毛。腹面略凹。鞭毛基部位置靠近細(xì)胞前端, 鞭毛或多或少地指向運動細(xì)胞的前部, 該運動細(xì)胞在運動過程中會快速旋轉(zhuǎn)。葉綠體單個, 覆蓋腹側(cè)和外側(cè), 并延伸到背側(cè)。腹側(cè)具單個眼點, 靠近細(xì)胞的中軸。鞭毛基部附近有幾個伸縮泡。在模式種中存在2個蛋白核, 而其他物種則缺乏蛋白核。細(xì)胞和鞭毛覆蓋著多種類型的鱗片。原生質(zhì)體最外層的鱗片足夠大, 以至于在光學(xué)顯微鏡下可見。繁殖方式未知。

該屬為中國新記錄屬。根據(jù)Algaebase在線數(shù)據(jù)庫的記錄有Mesostigma virideLauterborn和Mesostigma grandeKorshikov兩種, 區(qū)分這兩種的關(guān)鍵特征在于蛋白核數(shù)量不同。亦有藻類學(xué)家認(rèn)為中眼藻屬為單種屬,M. grande為M. viride的異名。

綠色中眼藻(圖 1a—i)

圖1 本研究中采集的綠色中眼藻的形態(tài)特征Fig. 1 The morphological characteristics of Mesostigma viride cells

Mesostigma viride Lauterborn 1894

Lauterborn, R. Ueber die Winterfauna einiger Gew?sser der Oberrheinebene. Mit Beschreibungen neuer Protozoen. Biologische Centralblatt, 1894, 14:390—398

細(xì)胞扁平, 橢圓形或圓形, 稍不對稱, 呈黃綠色,細(xì)胞長14—20 μm, 寬11—16 μm(圖 1a、1b和1c);原生質(zhì)體外無細(xì)胞壁, 而是由多糖質(zhì)鱗片包被(圖 1e),且鱗片呈網(wǎng)狀(圖 1h); 細(xì)胞內(nèi)具1個大液泡(圖 1c),2—4個伸縮泡(圖 1g)及2個蛋白核(圖 1d); 葉綠體1個, 暗綠色, 片狀, 周生; 細(xì)胞腹側(cè)中軸處具1個眼點(圖 1a); 背側(cè)凹陷處具兩根鞭毛(圖 1i), 呈螺旋形前進(jìn)(可見其側(cè)面觀圖 1f)。以上特征與中眼藻(Mesostigma viride)形態(tài)特征符合, 故可判斷該藻為中眼藻。

該種為中國新記錄種。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

兩株中眼藻的18S rDNA序列長度分別為1649 bp(MW413341)和1605 bp(MW413342)。從環(huán)境樣本中獲得的18S rDNA V4區(qū)的5條序列長度分別為381 bp(Zotu1588)、382 bp(Zotu2528)、381 bp(Zotu 2676)、380 bp(Zotu3287)和380 bp(Zotu5259)。NCBI核酸數(shù)據(jù)庫對基因序列進(jìn)行相似性對比顯示以上7條序列與GenBank中已有的中眼藻序列相似度為100%。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的序列矩陣信息見表 3。

表3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹數(shù)據(jù)詳情Tab. 3 Details of the data used to build phylogenetic trees

基于中眼藻18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 2), 運用最大似然法和貝葉斯法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。本實驗所采集到的2株藻與Gen-Bank中已有的中眼藻KJ808698Mesostigma viride聚在一起, 其自展支持值和后驗概率分別為100和1.00, 支持本實驗所采集藻類為綠色中眼藻。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以明顯地看出, 中眼藻綱(Mesostigmatophyceae)與綠方藻綱 (Chlorokybophyceae)以較高的自展支持值和后驗概率聚為一枝。環(huán)境DNA系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示(圖 3), 5個不同的環(huán)境序列均以較高的自展支持值與綠色中眼藻聚在一起。另外, 通過對三峽水庫4個季節(jié)的環(huán)境DNA調(diào)查, 我們發(fā)現(xiàn)中眼藻在秋季出現(xiàn)的頻率最高,夏季僅在1個樣品中檢測到, 而冬春季節(jié)均未發(fā)現(xiàn)該藻。

圖2 基于中眼藻18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 The phylogram inferred from18S rDNA sequences of Mesostigma viride

圖3 基于環(huán)境中18S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The phylogram inferred from 18S rDNA sequences of environmental DNA

3 討論

不同于鞭毛位置位于細(xì)胞前端的綠藻, 中眼藻鞭毛位于背部凹陷處, 這使得其運動方式表現(xiàn)為特殊的螺旋式前進(jìn), 可作為區(qū)分中眼藻與其他常見單細(xì)胞鞭毛綠藻的重要特征。由于原生質(zhì)體外不具由纖維素和果膠組成的細(xì)胞壁, 中眼藻最初被認(rèn)為隸屬于蔥綠藻綱[31], 但分子系統(tǒng)發(fā)育研究表明這一類群并不是自然發(fā)生的。本研究結(jié)果表明, 中眼藻與鏈形植物門中的輪藻綱和綠方藻綱具有更近的親緣關(guān)系, 進(jìn)一步支持中眼藻在系統(tǒng)發(fā)育位置上處于鏈形植物門的基部, 這與Bhattacharya等[18]對中眼藻肌動蛋白的研究和Nedelcu 等[16]對中眼藻表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tags, EST)的研究結(jié)果一致。

依據(jù)環(huán)境樣本中獲取的18S rDNA V4區(qū)片段,我們發(fā)現(xiàn)三峽水庫多個區(qū)域存在中眼藻, 且主要出現(xiàn)在秋季。然而我們通過顯微觀察卻并未在這些水體中發(fā)現(xiàn)中眼藻, 這表明中眼藻可能比我們預(yù)期中要更難發(fā)現(xiàn), 同時也說明秋季可能是在中國內(nèi)陸采集中眼藻的最佳季節(jié)。不同18S rDNA V4區(qū)序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置略有區(qū)別, Zotu 3287和Zotu5259以72的自展支持值與AF408245Mesostigma viride聚為一枝; Zotu1588、Zotu2676和Zotu2528以79的自展支持值及90%的貝葉斯后驗概率與本研究中采集到的中眼藻聚為一枝; 而以上兩大分枝以99的自展支持值及100%的后驗概率分為兩枝, 這暗示了中眼藻屬中有可能存在隱存種。在以后的研究工作中, 應(yīng)用單細(xì)胞PCR手段獲取多個分子標(biāo)記進(jìn)行詳細(xì)比較, 同時獲取更為精細(xì)的顯微特征數(shù)據(jù), 對于解決這一問題可能較為有效。

目前, 對于中眼藻系統(tǒng)發(fā)育的研究結(jié)果表明中眼藻在鏈形植物類群中單獨形成一個深度發(fā)生的枝系, 與陸生植物有著密不可分的聯(lián)系, 是研究綠色植物從水生綠藻向陸生植物過渡的理想材料。本研究首次在中國發(fā)現(xiàn)并記錄了中眼藻屬,對中眼藻在中國內(nèi)陸水體的分布和出現(xiàn)時間進(jìn)行了初步推測, 為在中國開展中眼藻相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。