向 瑤 張金葉 趙元莙

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 動(dòng)物生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

黏孢子蟲(chóng)是一類(lèi)個(gè)體微小結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的后生動(dòng)物寄生蟲(chóng), 主要寄生于魚(yú)類(lèi), 有些種類(lèi)能引起魚(yú)類(lèi)宿主的病害[1—3], 嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致死亡[4—7]。其中兩極蟲(chóng)科(Myxidiidae Thélohan), 1892黏孢子蟲(chóng)與大多數(shù)黏孢子蟲(chóng)類(lèi)群不同, 具有最廣泛的宿主類(lèi)群,該科的種類(lèi)不僅能寄生于變溫動(dòng)物(海、淡水魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi))[8—12], 還能寄生于恒溫動(dòng)物(鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳類(lèi))[13,14]。有些物種還能廣泛寄生于多種不同的宿主, 如李氏腸黏蟲(chóng)(Enteromyxum leeiDiamant, Lom and Dykova), 1994的宿主已經(jīng)超過(guò)40種[15]。兩極蟲(chóng)屬(MyxidiumButschli, 1882)隸屬黏體門(mén)(Myxozoa)、黏孢子蟲(chóng)綱(Myxosporea)、雙殼目(Bivalvulida)、兩極蟲(chóng)科(Myxidiidae)[16], 是兩極蟲(chóng)科中種類(lèi)最多的屬, 迄今已記錄的種類(lèi)超過(guò)230種[9]。兩極蟲(chóng)屬種類(lèi)具如下特征: 2個(gè)孢子殼瓣,孢子呈紡錘形、梨形或橢圓形, 末端稍尖; 殼瓣表面光滑或具條紋, 孢子縫線(xiàn)直; 孢子的兩極端各具一個(gè)梨形或球形的極囊且極囊向兩端開(kāi)口, 細(xì)長(zhǎng)的極絲在極囊內(nèi)橫向盤(pán)曲; 孢子質(zhì)位于兩極囊之間。兩極蟲(chóng)為典型的腔寄生類(lèi)群, 絕大多數(shù)種類(lèi)寄生于宿主的膽囊或泌尿系統(tǒng), 極少數(shù)可營(yíng)組織寄生[2,17],個(gè)別組織寄生種類(lèi)甚至能導(dǎo)致寄生部位出現(xiàn)空泡影響宿主發(fā)育和繁殖[18]。

胭脂魚(yú)(Myxocyprinus asiaticusBleeker, 1864),隸屬鯉形目(Cypriniformes)胭脂魚(yú)科(Catostomidae)胭脂魚(yú)屬(Myxocyprinus), 是胭脂魚(yú)科唯一分布在我國(guó)的特有種[19,20], 現(xiàn)已在我國(guó)馴化為養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi),成為我國(guó)長(zhǎng)江流域重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一[21,22]。胭脂魚(yú)是雜食性的底棲魚(yú)類(lèi), 在人工養(yǎng)殖過(guò)程中常與其他不同食性和不同水層棲息的魚(yú)類(lèi)混養(yǎng)以充分利用不同水層的資源[23]。但混養(yǎng)易增加胭脂魚(yú)與其他不同魚(yú)類(lèi)的密切接觸機(jī)會(huì), 加大寄生蟲(chóng)或其他病原傳播的風(fēng)險(xiǎn), 進(jìn)而增高傳染性造成經(jīng)濟(jì)損失[24]。因此開(kāi)展對(duì)胭脂魚(yú)的寄生蟲(chóng)及其病害的研究也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚(yú)病防治的需要。

倒刺鲃兩極蟲(chóng)(Myxidium spinibarbaChen,et al.), 2020年最初從中華倒刺鲃[Spinibarbus sinensis(Bleeker, 1871)]的膽囊中檢獲[25]。本研究檢獲的倒刺鲃兩極蟲(chóng)分離自胭脂魚(yú)膽囊, 在對(duì)其重描述的基礎(chǔ)上, 結(jié)合其形態(tài)學(xué)與18S rDNA分子數(shù)據(jù), 比較分析寄生于不同宿主的倒刺鲃兩極蟲(chóng)及其他相似種之間的分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系, 旨在為寄生胭脂魚(yú)的黏孢子蟲(chóng)種類(lèi)組成及兩極蟲(chóng)的宿主多樣性積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黏孢子蟲(chóng)樣本采集和鑒定

宿主魚(yú)于2019年10月11日從重慶北碚區(qū)某養(yǎng)殖基地(該養(yǎng)殖基地由8個(gè)8.35 m×5.66 m的養(yǎng)殖池相連, 且池水互通; 多種魚(yú)類(lèi)以不同年齡、不同規(guī)格同池或者單獨(dú)輪養(yǎng)輪放)捕獲。共獲26尾無(wú)明顯病癥的胭脂魚(yú)帶回實(shí)驗(yàn)室解剖并進(jìn)行黏孢子蟲(chóng)檢測(cè), 其中4尾魚(yú)的膽囊檢獲到黏孢子蟲(chóng)(感染率為15.4%)。黏孢子蟲(chóng)收集、處理、測(cè)量和鑒定方法參照文獻(xiàn)[26]處理。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

從上述同一批次不同胭脂魚(yú)個(gè)體的膽囊內(nèi)分離獲得游離黏孢子蟲(chóng), 加入95%的乙醇溶液置于1.5 mL離心管保存。從離心管底部吸取10 μL黏孢子蟲(chóng)液體, 用超純水清洗2—3次, 離心(2000 ×g)沉淀后用于DNA提取。基因組DNA的提取嚴(yán)格參照DNeasy Blood & Tissue試劑盒(QIAGEN, Hilden, Germany)說(shuō)明書(shū)執(zhí)行, 將提取的基因組DNA置于-20℃保存、備用。黏孢子蟲(chóng)18S rDNA序列通過(guò)PCR技術(shù)利用引物18e: 5′-CTGGTTGATCCTGCC-3′[27]和18R: 5′-CTACGGAAACCTTGTTACG-3′[28]擴(kuò)增。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[29]。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè), 目的產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(OMEGA, 美國(guó))回收并送到上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將本研究獲得的序列, 在GenBank中用BLAST進(jìn)行同源序列檢索比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果, 選取12條高同源性序列(序列相似度高于89%), 24條先前相關(guān)研究所用序列[25]及本研究所獲的2條序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。另以Tetracapsuloides bryosalmonae(KF731712)和Buddenbrockia plumatellae(KF731691)為外群, 利用Mr Bayes 3.2.6[30]選用最優(yōu)擬合模型(GTR)運(yùn)行1000000代構(gòu)建Bayes(BI)樹(shù), 利用在線(xiàn)軟件CIPRES Science Gateway V.3.3(http://www.phylo.org/)選用RAxML-HPC2 XSEDE(8.2.12)模型構(gòu)建ML(Maximum likelihood)樹(shù)。最后用FigTree v1.4和Adobe Photoshop CC軟件編輯注釋系統(tǒng)樹(shù)。將相關(guān)18S rDNA序列用MEGA 6.0[31]設(shè)置執(zhí)行K2P模型多序列比對(duì)計(jì)算出遺傳距離, 利用在線(xiàn)序列比對(duì)工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)計(jì)算得出兩兩序列相似度, 結(jié)合MEGA和Bioedit軟件完成變異位點(diǎn)分析。

1.4 主成分分析

使用PAST 3軟件進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA), 對(duì)不同宿主寄生的倒刺鲃兩極蟲(chóng)株系的孢子長(zhǎng)、孢子寬、極囊長(zhǎng)、極囊寬和極囊間距5項(xiàng)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)比較[32]。利用變異協(xié)方差矩陣生成置信度為95%的散射圖。

2 結(jié)果

2.1 倒刺鲃兩極蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)重描述

取宿主魚(yú)的適量膽汁制片鏡檢, 未見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)體和未成熟孢子, 但可見(jiàn)大量成熟孢子。成熟孢子殼面呈梭形, 兩端稍尖。孢子縫面呈卵圓形, 縫脊平直,孢子殼瓣上有7—10條與縫脊平行的條紋(圖 1)。孢子長(zhǎng)為(12.59±0.56) μm (11.55—13.36 μm), 孢子寬為(5.92±0.40) μm (5.11—6.86 μm)。兩個(gè)極囊呈梨形位于孢子兩端, 大小相等, 其開(kāi)口傾向孢子兩端。極囊長(zhǎng)為(3.48±0.36) μm (2.63—4.22 μm), 極囊寬為(2.83±0.26) μm (2.29—3.21 μm)。兩極囊間隔(3.66±0.29) μm (3.12—4.20 μm), 極絲盤(pán)曲4—5圈(表 1)。

表1 寄生不同宿主的倒刺鲃兩極蟲(chóng)的特征比較Tab. 1 Comparison among Myxidium spinibarba from different hosts

圖1 寄生于胭脂魚(yú)的倒刺鲃兩極蟲(chóng)孢子顯微圖片F(xiàn)ig. 1 Photomicrographs of Myxidium spinibarba from Myxocyprinus asiaticus

2.2 18S rDNA分子特征和系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究從不同個(gè)體的胭脂魚(yú)樣本中獲得2條18S rDNA序列, 長(zhǎng)度分別為1785(MT775466)和1913 nt (MT775467)。比對(duì)結(jié)果顯示, 所獲兩條18S rDNA序列之間相似度為100.00%, 在可比對(duì)長(zhǎng)度(1785 nt)上無(wú)變異位點(diǎn)。兩條序列在NCBI中BLAST分析顯示: 與寄生于中華倒刺鲃的倒刺鲃兩極蟲(chóng)(MH766654)的相似度最高, 為99.9%—100.0%,MT775467與Myxidium spinibarba(MH766654)在可比對(duì)長(zhǎng)度范圍內(nèi)(1913 nt)僅有1個(gè)變異位點(diǎn); 其次與Myxidiumsp.(MK913426)和Zschokkellasp.(KM 401441)具有較高相似度(表 2)。

表2 黏孢子蟲(chóng)基于18S rDNA序列遺傳距離與相似度Tab. 2 Genetic distances and similarities of myxosporeans based on 18S rDNA sequences

基于18S rDNA序列構(gòu)建的ML和BI樹(shù)顯示出一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。兩棵系統(tǒng)樹(shù)均顯示: 所選取黏孢子蟲(chóng)序列被分成A、B兩個(gè)大分支(圖 2)。A支是一混合支系, 包括寄生于爬行動(dòng)物的兩極蟲(chóng)、海水魚(yú)類(lèi)的兩極蟲(chóng)和楚克拉蟲(chóng)及淡水魚(yú)類(lèi)的兩極蟲(chóng)和楚克拉蟲(chóng); 而B(niǎo)支則完全由寄生海水魚(yú)類(lèi)的兩極蟲(chóng)組成。本研究株系位于A支內(nèi), 其中株系(MT775466)與倒刺鲃兩極蟲(chóng)(MH766654)聚支后, 再與株系(MT775467)聚支, 形成倒刺鲃兩極蟲(chóng)支系; 然后, 與Zschokkellasp. (KM401441)和Myxidiumsp. (MK913426)亞支再形成了姐妹支。

圖2 基于18S rDNA序列構(gòu)建的BI/ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree generated by BI/ML based on 18S rDNA sequences

2.3 基于寄生不同宿主的倒刺鲃兩極蟲(chóng)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析

主成分分析結(jié)果顯示本研究?jī)芍晗?MT775466和MT775467)與倒刺鲃兩極蟲(chóng)(MH766654; 該株系原始數(shù)據(jù)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室)在5項(xiàng)形態(tài)特征結(jié)合生成的橢圓散點(diǎn)圖上均有重合, 其中●株系(MT775466)散點(diǎn)圖基本覆蓋*株系(MH766654)散點(diǎn)圖, ▲株系(MT775467)的散點(diǎn)圖僅與前兩者的散點(diǎn)圖部分重疊(圖 3)。

3 討論

本研究?jī)芍晗敌螒B(tài)學(xué)和生態(tài)學(xué)特性均顯示一致, 應(yīng)屬于同一物種。本研究獲得的兩極蟲(chóng), 兩端稍尖的梭形成熟孢子、平直的縫脊和殼瓣上的條紋數(shù)、兩個(gè)大小相等的梨形極囊、極絲圈數(shù)及極絲開(kāi)口方向等形態(tài)學(xué)特征均與倒刺鲃兩極蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征一致[25], 且兩者的感染部位均為膽囊。同時(shí), 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果也顯示: 盡管株系(MT775467)有略微的差異, 但本研究的2個(gè)株系的形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)基本都與倒刺鲃兩極蟲(chóng)的形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)有大幅重疊(圖 3), 僅存在少許差異, 這樣的形態(tài)學(xué)量度差異在種內(nèi)變化范圍內(nèi)[33]。綜合形態(tài)學(xué)與主成分分析結(jié)果, 本研究獲得的兩極蟲(chóng)與倒刺鲃兩極蟲(chóng)當(dāng)屬同種。

圖3 寄生不同宿主倒刺鲃兩極蟲(chóng)的孢子形態(tài)差異主成分分析Fig. 3 Principal component analysis on morphological differences of Myxidium spinibarba from different hosts

鑒于黏孢子蟲(chóng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 學(xué)者們?cè)谝酝难芯恐姓J(rèn)為在對(duì)黏孢子蟲(chóng)進(jìn)行物種鑒定和描述時(shí), 應(yīng)當(dāng)綜合考慮該黏孢子蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征、生態(tài)學(xué)特征(宿主、寄生部位、地理分布)和分子特征[34,35]?；诖? 盡管本研究株系的宿主與原始描述宿主不同,但其18S rDNA序列比對(duì)結(jié)果顯示寄生胭脂魚(yú)的兩株系與中華倒刺鲃株系之間僅有1個(gè)變異位點(diǎn), 遺傳距離和相似度分別為0.000—0.001和99.9%—100.0%, 符合已有研究給出的黏孢子蟲(chóng)變異位點(diǎn)不超過(guò)10個(gè), 遺傳距離在0.000—0.007, 相似度在98.6%—100%屬于種內(nèi)水平的判別標(biāo)準(zhǔn)[36—39]。分子特征分析也表明本研究所獲寄生胭脂魚(yú)的兩極蟲(chóng)株系(MT77546和MT775467)與寄生中華倒刺鲃的倒刺鲃兩極蟲(chóng)(MH766654)為同一物種。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示: 寄生不同宿主的倒刺鲃兩極蟲(chóng)株系嵌合聚枝, 寄生胭脂魚(yú)的倒刺鲃兩極蟲(chóng)株系(MT775467)先分化, 并與前述的主成分分析和18S rDNA特征分析結(jié)果表現(xiàn)一致。同種兩極蟲(chóng)可在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的魚(yú)類(lèi)宿主寄生, 這與已有的關(guān)于弧形蟲(chóng)和腸黏蟲(chóng)的研究有著明顯的一致性[33,40]。在本研究所顯示的倒刺鲃兩極蟲(chóng)姐妹支中, 寄生于露斯塔野鯪[Labeo rohitaHamilton, 1822(鯉形目)]的Zschokkellasp.(KM401441)與寄生于長(zhǎng)臀[Cranoglanis bouderiusRichardson, 1846(鲇形目)]的Myxidiumsp.(MK913426)形成高支持率(0.99/84)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系也得到了旁證: 盡管Zschokkellasp.(KM401441)與Myxidiumsp.(MK 913426)為不同種類(lèi)且宿主親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 但顯示形態(tài)學(xué)特征較為相似, 都享有梭形的孢子并具有梨形極囊(圖 2)。兩極蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系與孢子形態(tài)、腔寄生的寄生部位趨向性等可能更相關(guān)。在通常情況下, 內(nèi)寄生蟲(chóng)的進(jìn)化在很大程度上受其與宿主相互作用的影響, 基于黏孢子蟲(chóng)SSU rDNA的大數(shù)據(jù)集系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果認(rèn)為組織寄生物種是由類(lèi)似祖先型的腔寄生黏孢子蟲(chóng)進(jìn)化而來(lái)[41,42]。寄生魚(yú)類(lèi)的碘泡蟲(chóng)類(lèi)黏孢子蟲(chóng)多為組織寄生, 是黏孢子蟲(chóng)中進(jìn)化較晚的類(lèi)群[42]。絕大多數(shù)碘泡蟲(chóng)類(lèi)的黏孢子蟲(chóng)寄生于淡水魚(yú)且具有明顯的宿主特異性乃至寄生部位特異性, 往往只感染一種宿主甚至只感染一種宿主的某一特定器官或組織[35]。而腔寄生的兩極蟲(chóng)類(lèi)是相對(duì)組織寄生的碘泡蟲(chóng)類(lèi)較為祖先的類(lèi)群, 進(jìn)化過(guò)程中分化形成海水支系和淡水支系, 其變異程度要比碘泡蟲(chóng)等組織寄生類(lèi)群更大,更易于對(duì)環(huán)境及宿主的變化形成適應(yīng)[41,42]。此外,先前基于魚(yú)體混養(yǎng)、受感染魚(yú)宿主的生活水體、經(jīng)口飼喂和肛門(mén)插管等途徑對(duì)李氏腸黏蟲(chóng)傳播實(shí)驗(yàn)研究表明, 李氏腸黏蟲(chóng)可感染多種不同且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的魚(yú)類(lèi)宿主[43], 也說(shuō)明腔寄生的兩極蟲(chóng)類(lèi)黏孢子蟲(chóng)對(duì)宿主具有更廣泛的適應(yīng)性。鑒于此, 推測(cè)本研究中倒刺鲃兩極蟲(chóng)也可能具有多宿主特征, 能寄生多種不同宿主, 但這還需要更多研究予以證實(shí)。

綜上, 本研究首次在胭脂魚(yú)體內(nèi)檢獲黏孢子蟲(chóng),胭脂魚(yú)是倒刺鲃兩極蟲(chóng)的新宿主; 寄生胭脂魚(yú)的倒刺鲃兩極蟲(chóng)株系(MT775467)先分化。本研究也為寄生胭脂魚(yú)的黏孢子蟲(chóng)種類(lèi)組成積累了新的數(shù)據(jù)。