陳金梅 褚一凡 譚啟洋 劉 偉 楊玲麗 黃 濤 吳振斌 賀 鋒

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

人工濕地是人工建造的, 通過(guò)基質(zhì)、植物和微生物的物理、化學(xué)、生物三重協(xié)同作用來(lái)凈化污水的一種技術(shù)[1]。植物作為人工濕地重要組成部分之一, 不僅能攝取利用污水中營(yíng)養(yǎng)物、吸收富集有毒有害物質(zhì), 還具有傳輸氧氣、強(qiáng)化根際微生物、增強(qiáng)和維持介質(zhì)的水利傳輸?shù)茸饔谩Ｈ欢参镌谌斯竦匚鬯畠艋^(guò)程中的作用與其生長(zhǎng)狀況密切相關(guān), 在氣溫低下的冬天, 植物進(jìn)入休眠期甚至枯萎死亡, 不能在濕地系統(tǒng)中充分發(fā)揮其功能, 從而導(dǎo)致人工濕地系統(tǒng)在冬季凈化效果下降。

目前現(xiàn)有的提高濕地植物的抗寒性方法主要有天然植物的抗寒性篩選[2,3]、誘變育種[4,5]和化學(xué)誘導(dǎo)[6]。本研究采用脫落酸處理濕地植物, 以期提升其抗寒性能。脫落酸(Abscisic acid, ABA) 作為植物五大激素之一, 是一種存在于植物體內(nèi)的具有倍半萜結(jié)構(gòu)的內(nèi)源激素。有研究表明[7], ABA 作為重要的逆境信號(hào)分子, 可誘導(dǎo)抗寒基因發(fā)揮作用,即, 當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí), 植物體內(nèi) ABA 會(huì)迅速累積, 啟動(dòng)或誘導(dǎo)植物自身抗寒基因的表達(dá), 參與低溫脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑, 從而使植物更快適應(yīng)寒冷。ABA參與的抗寒過(guò)程一般分為3種: 一種是ABA依賴途徑, 主要受轉(zhuǎn)錄因子和ABRE的調(diào)控[8,9],如PYR/PYL/RCARs(受體)、PP2C(負(fù)調(diào)控)和SnRK2s(正調(diào)控); 另外逆境誘導(dǎo)基因 RD28 和RD29 等也受ABA調(diào)控; 第二種是非ABA依賴途經(jīng),然而ABA的信號(hào)傳導(dǎo)還是會(huì)影響基因的表達(dá), 如lti78; 第三種是ABA與低溫協(xié)同作用下才進(jìn)行表達(dá)的基因, 例如cor47基因在經(jīng)外源ABA處理后, 表達(dá)量有所升高[10,11]。由于研究ABA的相關(guān)生理過(guò)程可反映植物的抗逆機(jī)理, 揭示其應(yīng)答基因及表達(dá)蛋白, 可定向增強(qiáng)作物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力, 故被廣泛應(yīng)用于園藝和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的抗寒性[12,13]、抗旱性[14,15]、鹽脅迫[14]及沉水植物的金屬脅迫[16,17]中。綜上所述, 適宜濃度下的外源脫落酸預(yù)處理可增強(qiáng)植物抗逆生物效應(yīng), 但其在濕地植物領(lǐng)域的研究還未見報(bào)道。因此, 本研究擬將外源脫落酸應(yīng)用于濕地植物美人蕉上探究其在低溫狀態(tài)下的生理響應(yīng)。

美人蕉(Canna indicaL.)屬多年生熱帶和亞熱帶植物, 喜溫, 抗寒能力差, 生物量大, 適應(yīng)力強(qiáng), 根系發(fā)達(dá), 被廣泛應(yīng)用于長(zhǎng)江中下游的人工濕地系統(tǒng)中。時(shí)至今日, 已有學(xué)者對(duì)提高濕地植物的抗寒性進(jìn)行大量探索, 但尚未探究外源脫落酸對(duì)濕地植物美人蕉耐寒性的影響。故本研究將采用不同濃度ABA處理美人蕉幼苗的葉片, 通過(guò)測(cè)定其抗寒指標(biāo)的變化, 確定最適宜的脫落酸施用濃度, 再將其應(yīng)用于人工濕地小試系統(tǒng)中, 探究適宜濃度的外源ABA對(duì)美人蕉植物本身抗寒能力的影響及其對(duì)自然冬季條件下人工濕地水質(zhì)的反饋效果, 為突破濕地系統(tǒng)低溫運(yùn)行瓶頸提供新思路。

1 材料與方法

1.1 植物處理與方法

紅花美人蕉幼苗來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所官橋研究基地, 取長(zhǎng)勢(shì)相近的美人蕉幼苗移植于塑料盆中, 幼苗高度為30—50 cm, 從基地移栽后在恒溫室進(jìn)行14d的緩苗期, 待長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定后, 放入低溫光照培養(yǎng)箱中, 每組設(shè)置3個(gè)平行, 均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

試驗(yàn)設(shè) 6 個(gè)處理組, 為 0、5、10、15、20和25 mg/L ABA, 對(duì)照組(CK)為0 mg/L ABA美人蕉幼苗組。為模擬自然降溫及日夜溫差等因素, 本實(shí)驗(yàn)采取階段性降溫培養(yǎng), 低溫光照培養(yǎng)各階段的溫度梯度設(shè)置為晝/夜20℃/18℃、 15℃/13℃、10℃/8℃、 5℃/3℃和0℃/0℃, 光照參數(shù)為2300 lx, 8h。每個(gè)溫度持續(xù)3d, 3d后自動(dòng)降至下一梯度, 且在溫度梯度切換時(shí)噴施一次相應(yīng)濃度ABA至葉面完全浸濕, 于0℃時(shí)采集植株頂部從上往下第 2 至第 3位葉, 液氮冷凍保存于-80℃冰箱中, 留存并測(cè)定其相關(guān)生理生化指標(biāo)。

1.2 植物生理生化指標(biāo)測(cè)定

各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定參照李合生等[18—20],相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法, 丙二醛測(cè)定采用硫代巴比妥酸法, 脯氨酸采用茚三酮顯色法, 總可溶性糖采用蒽酮-硫酸比色法, 可溶性蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)G-250法, SOD測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法, CAT測(cè)定采用過(guò)氧化氫比色法, POD采用愈創(chuàng)木酚法, 葉綠素測(cè)定采用乙醇法。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置與方法

本研究采用垂直流人工濕地, 裝置為內(nèi)徑200 mm、管高870 mm的PVC管, 裝置內(nèi)填充基質(zhì)依次為100 mm高的粒徑為5—8 mm粗礫石、300 mm高的粒徑為2—4 mm細(xì)礫和200 mm高的粒徑為0.5—1 mm石英砂(圖 1)。裝置正式運(yùn)行時(shí)間為2019年12月至2020年1月, 采取自然降溫模式, 裝置設(shè)3個(gè)平行, 組別分別為無(wú)植物組(A組)、植物對(duì)照組(B組)和ABA噴施處理組(C組), 植物對(duì)照組和ABA噴施處理組各種植一株紅花美人蕉, 種植深度10 cm。進(jìn)水采用自配水, 配方如下: 蛋白胨80 g/m3、牛肉膏55 g/m3、葡萄糖100 g/m3、NaCl 3.5 g/m3、NH4Cl 28.5 g/m3、CaCl22 g/m3、MgSO41 g/m3和K2HPO419 g/m3。主要指標(biāo)含量為CODcr (211.6±37.6) mg/L、TN (28.07±1.83) mg/L和TP (2.62±0.25) mg/L。

圖1 試驗(yàn)裝置圖Fig. 1 Illustration of test installation

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0單因素方差分析對(duì)植物生理生化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 采用SPSS 17.0單因素方差分析對(duì)人工濕地各處理組和對(duì)照組的去除率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 各分析的顯著性水平為P＜0.05, 并用Origin8進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 0℃時(shí)各處理組生理指標(biāo)含量變化的情況

細(xì)胞膜系統(tǒng)丙二醛(MDA)、相對(duì)電導(dǎo)率含量的變化由圖 2可以看出, MDA各組之間均有顯著性差異(P＜0.05), 其中15 mg/L脫落酸處理的美人蕉幼苗的MDA相比對(duì)照組降低了50.24%。此外, 在0℃時(shí)(圖 3), 相對(duì)電導(dǎo)率各處理組與對(duì)照組之間均有顯著性差異(P＜0.05), 但各處理組之間無(wú)顯著性差異。

圖2 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉片丙二醛的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of ABA on malondialdehyde in Canna indica L. at 0℃

圖3 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of ABA on relative conductivity in Canna indica L. at 0℃

在低溫條件下, 相比于對(duì)照組, 15和20 mg/L的ABA處理組顯著地增加脯氨酸在美人蕉幼苗葉片中的含量(P＜0.05), 相較于對(duì)照組增加到2.113倍(圖 4), 15 mg/L的ABA處理組顯著地增加蛋白質(zhì)在美人蕉幼苗葉片中的含量, 且相較于對(duì)照組增加到2.01倍(圖 5)。此外, 10 mg/L的ABA處理組顯著地增加可溶性糖在美人蕉幼苗葉片中的含量, 相比于對(duì)照組增加到3.095倍(圖 6)。

圖4 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉片脯氨酸的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of ABA on proline content in Canna indica L. at 0℃

圖5 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉片蛋白質(zhì)的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of ABA on soluble protein content in Canna indica L. at 0℃

圖6 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉片總可溶性糖的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of ABA on total soluble sugar content in Canna indica L. at 0℃

抗氧化酶活性的變化由圖 7可以看出, 0℃時(shí)經(jīng)ABA處理的美人蕉幼苗與對(duì)照組相比均有顯著性提高, 且10 mg/L處理組尤為顯著(P＜0.05)。POD酶規(guī)律性不強(qiáng), 只有在25 mg/L處理組下才與對(duì)照組有顯著性差異(圖 8)。CAT酶也可反映植物的抗逆性, 但在本實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(圖 9)。

圖7 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉片SOD的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of ABA on activities of SOD in Canna indica L. at 0℃

圖8 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉片POD的影響Fig. 8 Effects of different concentrations of ABA on activities of POD in Canna indica L. at 0℃

圖9 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉片CAT的影響Fig. 9 Effects of different concentrations of ABA on activities of CAT in Canna indica L. at 0℃

葉綠素含量變化由圖 10可以看出, 10、15、20和25 mg/L 的ABA處理組相比對(duì)照組均有顯著性提高(P＜0.05), 其中經(jīng)15 mg/L ABA處理組與對(duì)照組相比, 可將植物葉片中的葉綠素提高1.8倍。

圖10 0℃時(shí)不同濃度ABA對(duì)美人蕉葉綠素的影響Fig. 10 Effects of different concentrations of ABA on chlorophyll in Canna indica L. at 0℃

2.2 人工濕地系統(tǒng)冬季運(yùn)行效果

表1所示為人工濕地運(yùn)行在冬季運(yùn)行期間的采樣時(shí)間及當(dāng)日的最低最高溫度統(tǒng)計(jì)結(jié)果, 運(yùn)行期間的COD、 TP和TN去除率測(cè)定結(jié)果如圖 11—13所示。

表1 冬季應(yīng)用試驗(yàn)期間溫度實(shí)測(cè)結(jié)果Tab. 1 Illustration of temperature measurement during winter

圖11 冬季COD去除率趨勢(shì)圖Fig. 11 Removal rates of COD in winter

由COD去除率結(jié)果可知, A組(無(wú)植物組)COD去除率為58.73%, B組(植物對(duì)照組)去除率為70.27%, C組(ABA噴施組)去除率79.49%, 三組間COD去除率有顯著性差異(P＜0.05)。對(duì)TP去除率分析可知, A組去除率為23.69%, B組去除率為35.34%, C組去除率30.98%, 有植物組顯著高于無(wú)植物組(P＜0.05), 但植物對(duì)照組與ABA噴施組無(wú)顯著性差異, 這可能與冬季植物未完全枯萎相關(guān)。由圖 13可知, A組去除率為26.67%, B組去除率為32.68%, C組去除率41.16%, 在試驗(yàn)前期, 三組TN去除率沒(méi)有顯著性差異且處于較平穩(wěn)狀態(tài), 到后期,植物長(zhǎng)勢(shì)較好的組TN的去除率顯著高于無(wú)植物組。

圖12 冬季TP去除率趨勢(shì)圖Fig. 12 Removal rates of TP in winter

圖13 冬季TN去除率趨勢(shì)圖Fig. 13 Removal rates of TN in winter

3 討論

3.1 各處理組抗寒性比較分析

在高等植物體內(nèi), 細(xì)胞膜系統(tǒng)最容易受到低溫迫害。低溫會(huì)影響膜的通透性, 從而使細(xì)胞膜受損, 根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研, 相對(duì)電導(dǎo)率也與膜損傷程度呈正比[21—23]。在逆境脅迫下, 植物體內(nèi)原有的自由基平衡被破壞, 多余的自由基會(huì)引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用[24]。膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一丙二醛(MDA), 其積累會(huì)對(duì)植物細(xì)胞膜造成一定傷害, 因?yàn)樗鼤?huì)和與蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合, 抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的合成, 甚至可以減弱纖維素分子間的橋鍵連接[19,20,24]。在對(duì)水稻[25]、油棕[26]和甘蔗[27]等的研究中發(fā)現(xiàn), 在外源 ABA 處理下, 植物體內(nèi)中的MDA 積累量和相對(duì)電導(dǎo)率均降低, 進(jìn)而減輕低溫對(duì)細(xì)胞膜的脅迫作用[28]。在本實(shí)驗(yàn)研究中也有相似結(jié)論, 0℃時(shí)外施脫落酸通過(guò)降低相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量減緩低溫脅迫給膜結(jié)構(gòu)帶來(lái)的損傷, 維持膜正常生理功能,誘導(dǎo)抗寒基因表達(dá), 從而增強(qiáng)植物抗冷性。究其原因, 推測(cè)是外源ABA 可提高水分由根系向葉片輸送效率, 提高細(xì)胞膜透性, 從而使膜的穩(wěn)定性增加以減少電解質(zhì)的滲漏, 此外, ABA還可誘導(dǎo)有關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而提高植物對(duì)寒冷的抵抗能力[27,29]。由圖 2可知, MDA濃度隨ABA濃度呈現(xiàn)先增后降再升的趨勢(shì), 推測(cè)低濃度或高濃度的ABA預(yù)處理會(huì)加重寒害對(duì)植物葉片細(xì)胞膜的損傷, 據(jù)圖 3可知, 相對(duì)電導(dǎo)率在所選濃度區(qū)間呈現(xiàn)相似的效果, 據(jù)文獻(xiàn)[22, 23]可知, ABA對(duì)細(xì)胞膜有一定的保護(hù)作用, 但針對(duì)不同植物其對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的處理敏感度較低,效果一般, 而適宜濃度下更能緩解膜脂氧化程度,故需要多個(gè)生理生化指標(biāo)來(lái)綜合判斷。

在低溫脅迫下, 植物細(xì)胞通過(guò)積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)緩解低溫對(duì)植物本身造成的傷害[30—32]。其中, 參與相關(guān)過(guò)程的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)有脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖, 一方面可保護(hù)蛋白質(zhì)分子來(lái)緩解低溫脅迫對(duì)細(xì)胞傷害, 另一方面啟動(dòng)植株體內(nèi)的抗寒機(jī)制, 誘導(dǎo)合成相關(guān)蛋白質(zhì), 形成脫落酸等物質(zhì)[28,33—35]。以往的研究結(jié)果表明, 施加外源ABA 可通過(guò)提高植物體中可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來(lái)增強(qiáng)植物的抗寒性, 并使其逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境[33,36]。在本實(shí)驗(yàn)中, 在0℃時(shí), ABA濃度與可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量整體均呈現(xiàn)低促高抑的趨勢(shì), 這說(shuō)明在適宜濃度的ABA預(yù)處理下, 美人蕉幼苗體內(nèi)通過(guò)調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)來(lái)平衡細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì), 此外細(xì)胞膜的穩(wěn)定性也會(huì)大大增強(qiáng), 進(jìn)而提高美人蕉幼苗對(duì)低溫的抵抗能力[21]。

低溫會(huì)降低植物對(duì) O2的利用能力, 打破植物體內(nèi)的活性氧( Reactive Oxygen Species, ROS)平衡, 過(guò)量的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞大分子, 引起一系列有害的生化反應(yīng), 造成蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA 突變和酶失活等, 進(jìn)而損傷植株[24,37—39]。在本研究中, SOD、POD和CAT未見明顯的規(guī)律性,這一現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與美人蕉響應(yīng)低溫脅迫的不同途徑有關(guān), 也可能是ABA預(yù)處理對(duì)該系統(tǒng)的效果不顯著或者是美人蕉物種與其他物種間響應(yīng)機(jī)制的差別, 尚需進(jìn)一步研究, 但此結(jié)果與前人在茶葉葉片[36]、玉米幼苗[40]和橡膠樹芽[41]等中的研究結(jié)論相符。

葉綠素是作物進(jìn)行光合作用的主要物質(zhì), 是植物所有生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。低溫脅迫會(huì)使葉綠素合成受阻, 且低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng), 葉綠素含量越少, 伴隨著葉綠素含量的降低, 葉片光合作用也隨之衰退[42]。研究表明, 造成葉綠素含量減少的原因有很多, 一部分學(xué)者[35,43—45]認(rèn)為, 低溫使原有葉綠素受到破壞是葉綠素含量減少的主要原因; 另一部分學(xué)者[46]則認(rèn)為葉綠素含量的下降主要是因?yàn)榈蜏叵拗屏巳~綠素的合成。而逮明輝等[47]認(rèn)為在低溫下葉片的葉綠素降解加劇, 合成能力降低, 才是導(dǎo)致葉綠素總含量下降的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn), 適宜濃度的脫落酸應(yīng)用可以提高低溫脅迫下美人蕉葉片中葉綠素含量, Wang 等[48]認(rèn)為被植物色素A(phyA)和phyB感知到的遠(yuǎn)紅光(FR)和紅光(R)分別正向和負(fù)向調(diào)節(jié)番茄的耐寒性, 這種調(diào)節(jié)有關(guān)脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)等植物激素及ABA和JA相關(guān)基因相關(guān), 而此種響應(yīng)在水稻[49]和Bermudagrass[50]中也有發(fā)現(xiàn)。

3.2 人工濕地低溫狀態(tài)下凈化效果比較分析

有研究認(rèn)為, 人工濕地即使在冬季低溫下仍對(duì)COD有較好的去除率[51]。本研究證明, 植物確實(shí)可顯著提高濕地對(duì)COD的去除, 且植物在冬季長(zhǎng)勢(shì)越好, 存活時(shí)間越久, COD的去除效率就越高, 這與華昇等[52]研究結(jié)果相符。濕地植物在生長(zhǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源是污水中的無(wú)機(jī)氮[53], 已有研究表明, 不同濕地植物對(duì) TN 的吸收量?jī)H占人工濕地 TN 去除量的 0.6%—17.3%[54], 本實(shí)驗(yàn)也可看出在寒冷的冬季, 人工濕地的TN的去除率偏低, 植物的對(duì)N的同化吸收確實(shí)可以在一定程度上提高冬季濕地的運(yùn)行效果。眾多學(xué)者認(rèn)為, TN的去除率因季節(jié)原因波動(dòng)較大[55], 夏季TP的去除率比冬季高6.1%—34.0%[56]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 植物耐寒性的提高對(duì)人工濕地中TN的去除率影響較小, 推測(cè)是因?yàn)橹参飳?duì)磷的去除起小部分作用, 主要還是靠基質(zhì)的吸附和微生物的作用。

4 結(jié)論

在低溫脅迫下, 一定濃度的外源脫落酸預(yù)處理使美人蕉葉片中的葉綠素、脯氨酸、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量升高, 丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率降低,但SOD、POD和CAT未見明顯的規(guī)律性, 綜合各項(xiàng)生理生化指標(biāo)及表觀現(xiàn)象, 適宜的ABA處理濃度為15 mg/L。用15 mg/L的脫落酸對(duì)美人蕉幼苗進(jìn)行預(yù)處理時(shí)可顯著提高人工濕地冬季TN、COD和TP去除率。