黃 薇 周華書 劉蘭英 羅土炎 宋永康

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所, 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室, 福州 350003;2. 周寧縣水產(chǎn)技術(shù)站, 周寧 355400)

鱘鰉魚是地球上現(xiàn)存最古老的脊椎動物, 包括鱘屬Acipenser和鰉屬Huso, 共2屬21種, 其中我國擁有8種，是鱘鰉魚分布較多的國家[1]。目前, 鱘鰉魚的所有屬種均被列入世界珍稀瀕危物種, 如何妥善保護與開發(fā)利用這些珍稀瀕危物種, 已成為全世界亟不可待的研究課題[1,2]。近年來, 隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化鱘鰉魚細菌性疾病發(fā)生率不斷增加, 給這一珍貴物種造成了不可彌補的巨大損失[3]。

魚類的健康狀況與其生活的水環(huán)境密切相關(guān)[4]。水環(huán)境中生存著大量的已知和未知的細菌菌群, 在水質(zhì)調(diào)控、物質(zhì)代謝、生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定及疾病的發(fā)生與控制等方面都發(fā)揮著重要的作用[5]。崔丙健等[6]認為, 盡管在養(yǎng)殖水環(huán)境中病原菌的豐度較低, 但也可能在特定條件下大量增殖, 從而導(dǎo)致水產(chǎn)病害暴發(fā)。同時研究顯示, 養(yǎng)殖環(huán)境中病原菌的數(shù)量和種類與魚類疾病的發(fā)生幾率及發(fā)病類型呈顯著正相關(guān)[7]。因此, 為了更好的保護和培育鱘鰉魚這一珍貴物種, 闡明其養(yǎng)殖環(huán)境的菌群結(jié)構(gòu)組成是有必要的, 理解養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物種類和數(shù)量將有助于調(diào)控養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)平衡、疾病防控及病原菌的快速診斷。

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展, 國內(nèi)外學者在部分魚類養(yǎng)殖水環(huán)境中的微生物結(jié)構(gòu)組成方面的研究已經(jīng)取得了初步進展, 包括大黃魚(Larimichthys crocea)[8]、羅非魚(Tilapia larvae)[9]、縊蟶(Sinonovacula constricta)[10]和淡水蝦[11]等。然而對鱘鰉魚養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)組成研究尚未見到報道。因此, 本文采用高通量測序技術(shù)和實時熒光定量PCR等技術(shù)手段對福建省周寧縣中華鱘保種中心穩(wěn)定養(yǎng)殖的4個鱘鰉魚品種的網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體細菌群落結(jié)構(gòu)及潛在病原菌存在情況進行了分析, 為該中心鱘鰉魚養(yǎng)殖過程中的水質(zhì)調(diào)控及疾病預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗樣品來源于福建省周寧縣中華鱘保種中心(北緯27°11′, 東經(jīng)119°20′), 該中心的鱘鰉魚為水庫網(wǎng)箱養(yǎng)殖, 養(yǎng)殖區(qū)平均海拔700 m, 網(wǎng)箱6 m深水溫為13—23℃, 晝夜溫差不超過2℃, pH為6.8—7.2,網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度約200尾/網(wǎng)箱, 養(yǎng)殖所用餌料為人工配合飼料, 每天早晚投喂1次, 日投喂率為魚體體重的0.5%。樣品于2019年9月12日采集, 隨機選取中心穩(wěn)定養(yǎng)殖的4個鱘鰉魚品種(中華鱘A. sinensis、施氏鱘A. schrenckii、達氏鰉H. dauricus和大雜交鱘A. schrenckii♂×H. dauricus♀)養(yǎng)殖網(wǎng)箱各3個, 在每個網(wǎng)箱的四角各設(shè)1個采樣站位, 利用500 mL的含0.4 mg硫代硫酸鈉的無菌水樣采集袋采集水深5 m處(網(wǎng)箱水深6 m)的水樣, 將各網(wǎng)箱采集的水樣混合均勻后裝于滅菌容器, 4℃運輸和保存, 樣品相關(guān)指標的測定和DNA提取在24h內(nèi)完成。樣品命名: 中華鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品編號為Z1、Z2和Z3,施氏鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品編號為S1、S2和S3, 達氏鰉網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品編號為H1、H2和H3, 大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品編號為D1、D2和D3。

1.2 水質(zhì)測定

水溫、pH和溶解氧(DO)均在現(xiàn)場進行測定,采用便攜式多參數(shù)測試儀SG68-ELK-ISM(MettlerToledo, Zurich, Switzerland)進行測定, 儀器使用前均已校正。實驗室測定指標包括氨氮N)、總磷(TP)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)和五日生化需氧量(BOD5), 分析方法如下:N采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009)、TP采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-1989)、CODMn采用酸式滴定法(GB11892-1989)和BOD5采用稀釋與接種法(HJ05-2009)。

1.3 基因組DNA提取

取各網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體1 L, 首先利用5.0 μm濾膜濾去浮游動植物和大顆粒物; 再利用0.22 μm濾膜截留微生物。獲得的濾膜樣品利用強力水樣微生物總DNA提取試劑盒(MOBIO, Carlsbad, CA, USA)提取DNA, 用Qubit 2.0 熒光定量儀(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)進行定量, 提取的DNA樣品放置在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增和Illumina測序

PCR擴增采用16S rRNA基因V3—V4區(qū)的通用引物341F和805R。PCR反應(yīng)體系總體積 30 μL, 含模板DNA 20 ng。PCR擴增程序為: 94℃, 3min;(94℃, 30s; 45℃, 20s; 65℃, 30s)×5; (94℃, 20s;55℃, 20s; 72℃,30 s)×20; 72℃, 5min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)QIAquick PCR 純化試劑盒(Qiagen,Düsseldorf, Germany)純化后, 送生工生物工程(上海)股份有限公司Illumina MiSeq平臺進行高通量測序, 測序得到的原始數(shù)據(jù)提交到NCBI的 SRA數(shù)據(jù)庫, 序列登錄號為SRP251784。

1.5 高通量數(shù)據(jù)處理

Illumina MiSeq測序得到的原始數(shù)據(jù), 首先使用FLASH軟件[12]根據(jù)序列間的overlap關(guān)系將成對的序列拼接成一條序列; 再運用Cutadapt軟件[13]去除測序時加入的引物和接頭序列, 按照barcode標簽序列識別并區(qū)分樣品; 然后使用Prinseq軟件[14]對各樣品數(shù)據(jù)質(zhì)量進行質(zhì)控過濾; 所得各樣本的有效數(shù)據(jù)再經(jīng)過Usearch軟件[15]去除嵌合體以及進行Operational Taxonomic Units (OTUs)聚類分析; 對OTU代表序列利用Ribosomal Database Project (RDP)classifier比對RDP數(shù)據(jù)庫進行物種注釋[16]; 利用Mothur軟件對單樣品的微生物多樣性(alpha多樣性)進行分析[17]; 采用QIIME軟件計算兩兩樣本間的weighted UniFrac距離, 用于beta多樣性分析[18]。

1.6 熒光定量PCR標準曲線構(gòu)建及定量PCR

參考文獻中報道的鱘鰉魚典型致病菌16S rRNA序列設(shè)計的特異性引物序列, 經(jīng)過多重比對驗證試驗后, 篩選出3對PCR引物(表 1)。以所提樣品DNA為模板進行常規(guī)PCR擴增, 擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后, 與pMD18-T載體接連轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中, 挑取轉(zhuǎn)化后的陽性克隆子利用QIAGEN Plasmid Mini Kit(Qiagen, Düsseldorf,Germany)提取質(zhì)粒DNA, 送測序公司驗證插入的基因片段是否正確, 驗證正確后測定質(zhì)粒濃度并繪制標準曲線。

表1 用于實時熒光定量 PCR 檢測的引物Tab. 1 RT-PCR primers sequences used in assay

將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為標準模板, 采用LightCycler480 II型熒光定量PCR儀(Roche,Rotkreuz, Switzerland)進行實時熒光定量PCR擴增。熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積 10 μL, 含2×SG Fast qPCR Master Mix 5 μL, 模板DNA 10 ng。熒光定量PCR擴增程序為: 95℃, 3min; (95℃, 5s;55/60℃, 30s; 72℃, 45s)× 45; 72℃, 10min。熔解曲線條件: 95℃, 1min; 55℃, 30s; 95℃, 30s。所有反應(yīng)均設(shè)置3個重復(fù), 每輪反應(yīng)均以無菌 ddH2O 代替模板DNA作為陰性對照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

在本研究中, 平均值和標準偏差采用Excel軟件計算;P-values采用SPSS軟件計算, 單因素方差分析運用Least Significant Difference (LSD法); PCoA圖、柱狀圖、熱圖和韋恩圖采用R軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 鱘鰉魚養(yǎng)殖水體水質(zhì)分析

從表 2可以看出, 中華鱘保種中心水庫水質(zhì)良好, 水溫適合鱘魚生長, pH呈中性, 網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的DO、和CODMn達到Ⅱ類水質(zhì)標準,BOD5和TP達到Ⅲ類水質(zhì)標準。中華鱘及其他鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體的水質(zhì)指標含量基本一致, 除BOD5外, 不同品種鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體的水質(zhì)指標含量不存在顯著差異(P≥0.05)。

表2 四種鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體水質(zhì)分析Tab. 2 The characteristics of water quality in four sturgeon species cage culture environments (mean±SEM, n=3)

2.2 鱘鰉魚養(yǎng)殖水體細菌群落結(jié)構(gòu)特征分析

從表 3可知, 中華鱘、施氏鱘、達氏鰉和大雜交鱘養(yǎng)殖水環(huán)境樣品中分別獲得有效16S rRNA序列數(shù)為51537±3709、66785±13726、56344±19476和58587±7538 條, 平均每個樣品獲得OTUs為1163個。根據(jù)各樣品的Good’s coverage指數(shù)＞99%,可知本研究的測序結(jié)果可以代表樣本的真實情況。Alpha多樣性分析結(jié)果表明, 大雜交鱘養(yǎng)殖水體的OTUs及ACE要顯著高于其他品種, 表明大雜交鱘養(yǎng)殖水體中的物種總數(shù)較高。一般來說,BOD5值越高, 水質(zhì)有機物濃度越高, 細菌的物種數(shù)也會越豐富。除此之外, 其余Alpha多樣性指數(shù)(Chaol、Shannon和Simpson)無顯著性差異(P≥0.05), 表明各樣品間的微生物結(jié)構(gòu)組成基本一致。根據(jù)weighted Unifrac距離進行PCoA分析, 從分析結(jié)果可知(圖 1), PCoA圖的前3個主坐標可以代表83.1%的變量信息, 除其中一個中華鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品外, 其余樣品均聚在一起, 表明這些鱘鰉魚養(yǎng)殖水體中的微生物結(jié)構(gòu)和組成十分相似。

表3 Illumina測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Tab. 3 Statistical indexes calculated based on the Illumina sequencing data (mean±SEM, n=3)

圖1 基于weighted UniFrac距離的樣品細菌群落結(jié)構(gòu)PCoA分析Fig. 1 Principal coordinates analysis (PCoA) of community compositions in samples microbiota based on weighted UniFrac

12個鱘鰉魚養(yǎng)殖水體樣品共獲得20個門類細菌(圖 2)。不同品種鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水環(huán)境中的優(yōu)勢菌門基本一致, 均由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes組成, 這些優(yōu)勢門類分別占到所有樣品序列總數(shù)的88.81%—93.94%。其中, 豐度最高的菌門為Proteobacteria, 占樣品序列總數(shù)的35.98%—39.94%,其次是Actinobacteria, 占樣本序列總數(shù)的21.77%—24.70%。差異顯著性分析結(jié)果顯示, 這些優(yōu)勢細菌門在各鱘鰉品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的豐度不存在顯著性差異(P≥0.05), 說明各鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的微生物結(jié)構(gòu)組成在門水平上基本一致。

圖2 門水平下各鱘鰉魚品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中細菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig. 2 The taxonomic composition distribution in samples at the phylum level

在各鱘鰉魚品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品中, 共檢測到224個細菌屬, 對豐度前50的細菌屬進行熱圖分析(圖 3), 養(yǎng)殖水體中細菌種群有高達34.77%—58.81%的物種未分類, 除此之外相對豐度在2%以上的細菌屬主要有Ilumatobacter(3.59±0.97)%、Sediminibacterium(2.38±0.56)%、Acinetobacter(2.53±3.33)%、Spartobacteria_genera_incertae_sedis(2.13±0.68)%和Subdivision3_genera_incertae_sedis(2.01±1.91)%。同時統(tǒng)計結(jié)果顯示, 這些優(yōu)勢菌屬在各鱘鰉品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體的差異不顯著(P≥0.05), 表明在屬水平上, 各鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢菌屬結(jié)構(gòu)組成相似。

圖3 屬水平下各鱘鰉魚品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中細菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig. 3 The taxonomic composition distribution in samples at the genus level

2.3 鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體細菌群落組成比較分析

通過構(gòu)建韋恩圖來分析不同品種鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品中所共有的和特有的OTU數(shù)目(圖 4)。中華鱘、施氏鱘、達氏鰉和大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體共有了1059個OTUs, 統(tǒng)計分析表明, 共有的OTUs序列分別占中華鱘、施氏鱘、達氏鰉和大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體序列總數(shù)的99.13%、98.44%、99.21%和99.18%。因此, 不同鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的核心菌群是一致的。此外, 中華鱘、施氏鱘、達氏鰉和大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中還含有特有的OTUs分別為70、156、43和68個, 分別占中華鱘、施氏鱘、達氏鰉和大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體總序列數(shù)的0.13%、0.51%、0.08%和0.09%。

圖4 不同品種鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中共有的和特有的OTUsFig. 4 Venn diagram displaying the number of shared and unique OTUs in the different sturgeon cage culture water

2.4 中華鱘及其他鱘鰉魚養(yǎng)殖水體中潛在病原菌分析

在本研究檢測的網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品中共發(fā)現(xiàn)鱘鰉魚病原菌菌屬7個, 主要包括Aeromonas、Acinetobacter、Chryseobacterium、Edwardsiella、Flavobacterium、Pseudomonas和Vibrio。從表 4可以看出, 7個潛在病原菌菌屬在不同鱘鰉魚養(yǎng)殖水體中的分布規(guī)律較為接近, 但是7個潛在致病菌菌屬的相對豐度存在顯著性差異(P＜0.05), 除中華鱘養(yǎng)殖水體中Pseudomonas＞Flavobacterium外, 其余相對豐度大小均表現(xiàn)為:Acinetobacter＞Flavobacterium＞Pseudomonas＞Aeromoas＞Chryseobacterium＞Vibrio＞Edwardsiella。

表4 不同品種鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中潛在病原菌屬及分布Tab. 4 Potential pathogens distribution in the different sturgeon cage culture water (mean±SEM, n=3)

利用熒光定量PCR對已報道鱘鰉魚養(yǎng)殖過程中的典型病原菌進行檢測。從圖 5可以看出,A. hydrophila在養(yǎng)殖水體中的豐度[(7406±1892) copies/mL]要高于或顯著高于(P＜0.05)其他病原菌, 其次為F. columnar[(4889±1649) copies/mL)和P. fluorescens[(3259±1117) copies/mL)。

圖5 網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中病原微生物豐度Fig. 5 Frequency of pathogenic microorganisms in cage culture water

3 討論

養(yǎng)殖水體中存在著大量的已知和未知微生物,其與水生生物體內(nèi)寄生的微生物菌群相互作用、相互影響, 形成了復(fù)雜的細菌-細菌、細菌-宿主互作關(guān)系, 從而對水生生物的健康成長產(chǎn)生重要的影響[20]。大量的研究表明, 明確養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物結(jié)構(gòu)組成將有助于病害控制防治、益生菌篩選及病原菌發(fā)病機制研究等工作[8,21]。因此, 本研究采用高通量測序技術(shù), 對4種鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的微生物的結(jié)構(gòu)組成及潛在病原菌分布進行了分析和比較。

從16S rRNA基因高通量測序結(jié)果來看, 不同品種鱘鰉魚在同一水域同一管理條件下, 其養(yǎng)殖水體中核心菌群基本一致, 優(yōu)勢菌群主要由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes組成, 這與已報道的羅非魚[22]、草魚[23]、魚菜共生[24]和魚貝混養(yǎng)[25]等養(yǎng)殖水環(huán)境的優(yōu)勢菌群相似。研究顯示, Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Planctomycetes在脫氮除磷、降解大分子、有機物質(zhì)轉(zhuǎn)換及產(chǎn)生抗菌類物質(zhì)等密切相關(guān), 這些優(yōu)勢微生物的存在對于魚類健康養(yǎng)殖有重要意義[24,26,27]。而Verrucomicrobia是污染程度的指示菌群[28], 在未受污染的沉積物中普遍存在, 在污染的沉積物中出現(xiàn)缺失, 這與本研究檢測出鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水質(zhì)指標較好(處于Ⅱ—Ⅲ級)相吻合。同時, 新近的研究顯示, 魚類腸道中的優(yōu)勢微生物也來自于Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes[29,30], 這在一定程度上也說明了水生生物與其水環(huán)境中的微生物之間存在緊密的互作關(guān)系。

在屬水平上, 各樣品未分類的細菌(unclassified)占比都超過34%, 占比最高達到58.81%, 說明鱘鰉魚養(yǎng)殖水體中的微生物種類復(fù)雜多樣, 有大量的微生物未被人們熟知, 同時也表明利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離等方法很難得到全面、準確的結(jié)果[31]。因此, 為了更好地培育這一珍貴物種, 采用高通量測序技術(shù)闡明其養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物結(jié)構(gòu)組成十分必要。在水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中, 養(yǎng)殖環(huán)境中的許多致病菌, 尤其是條件致病菌大量增殖導(dǎo)致的水產(chǎn)病害頻發(fā)是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程面臨的主要問題[6]。該結(jié)果證實了鱘鰉魚典型病原菌在養(yǎng)殖環(huán)境中的普遍性, 本文采用高通量測序技術(shù)在網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣本中共發(fā)現(xiàn)鱘鰉魚病原菌菌屬7個。

基于16S rRNA片段基因高通量測序技術(shù)能夠解析樣本中微生物的總體結(jié)構(gòu), 取得更多不能通過分離培養(yǎng)技術(shù)獲取的細菌種類信息, 但限于二代高通量測序技術(shù)測序長度偏短, 其對于具體到種一級的信息辨別能力不足[20], 這對于獲取種間關(guān)系復(fù)雜的病原菌信息難度較大。為此, 本試驗利用實時熒光定量PCR的方法對網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境水體樣品中常見的典型鱘鰉魚致病菌進行定量檢測, 檢測結(jié)果顯示A. hydrophila在養(yǎng)殖水體中的豐度要高于F. columnar和P. fluorescens, 這與高通量測序檢測的致病菌屬結(jié)果不一致。盡管16S rRNA基因片段的PCR引物擴增的特異性會出現(xiàn)一定的差異, 但推測主要原因還是在于致病菌屬包含了不止一種的致病菌種。Aeromoas廣泛存在于自然界及健康魚體的腸道中,屬于條件致病菌。根據(jù)田甜等[3]和楊移斌等[32]的報道,A. hydrophila是中華鱘及其他鱘鰉魚病害最常見的病原菌, 可導(dǎo)致紅嘴病、腹水病和敗血癥等的發(fā)生。在鱘鰉魚的養(yǎng)殖過程中, 病原菌的早期監(jiān)控對疾病防控具有極為重要的作用, 本研究的結(jié)論將有助于針對性地指導(dǎo)對該區(qū)域中華鱘等鱘鰉魚養(yǎng)殖過程進行科學防病和水質(zhì)調(diào)控。

4 結(jié)論

在同一水域同一管理條件下, 不同品種鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的細菌組成與豐度基本一致, 優(yōu)勢菌門均由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes組成,優(yōu)勢菌屬為Ilumatobacter、Sediminibacterium、Acinetobacter、Spartobacteria_genera_incertae_sedis和Subdivision3_genera_incertae_sedis, 表明不同鱘鰉魚的養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境管理經(jīng)驗是可以相互借鑒的。在鱘鰉魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境中, 共發(fā)現(xiàn)鱘鰉魚病原菌菌屬7個:Aeromonas、Acinetobacter、Chryseobacterium、Edwardsiella、Flavobacterium、Pseudomonas和Vibrio, 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示, 在鱘鰉魚養(yǎng)殖過程中最常見的病原菌A. hydrophila的豐度最高, 為(7406±1892) copies/mL, 其次F. columnar的豐度為(4889±1649) copies/mL及P.fluorescens的豐度為(3259±1117) copies/mL。