謝夢(mèng)琪 張?jiān)娪?許荔立 蔣 飛 袁軍法, 吳志新, 陳孝煊,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2. 湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)中心, 武漢 430070;3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 武漢 430070)

腸道微生物生活在動(dòng)物胃腸道黏膜和內(nèi)容物中, 在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中, 與宿主之間形成了極為密切的關(guān)系。在正常生理狀態(tài)下, 腸道微生物之間通過(guò)相互作用維持著動(dòng)態(tài)平衡, 共同影響宿主的營(yíng)養(yǎng)、免疫、生產(chǎn)性能、生理狀態(tài)和疾病等過(guò)程[1,2]。研究表明, 許多腸道微生物可以分泌消化酶, 分解飼料中的淀粉和纖維素等物質(zhì), 為機(jī)體提供短鏈脂肪酸、氨基酸和維生素等[3], 促進(jìn)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)吸收[4]。許多微生物還可以促進(jìn)宿主免疫系統(tǒng)(包括免疫細(xì)胞和免疫組織)的發(fā)育[5], 并通過(guò)影響?zhàn)つし置诿庖咔虻鞍?、非特異性免疫和免疫?yīng)答等過(guò)程提高機(jī)體的健康狀況[6]。因此, 維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對(duì)提升宿主健康水平和促進(jìn)宿主生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。

影響腸道菌群穩(wěn)態(tài)的因素有很多, 例如宿主基因型、性別、環(huán)境、生長(zhǎng)階段和食物等。這在哺乳動(dòng)物中已有廣泛研究, 在魚類中的研究也有較多報(bào)道[7—12]。在甲殼動(dòng)物中, 有研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)成年雌性蟹的細(xì)菌群落多樣性高于雄性蟹, 不同生長(zhǎng)階段各細(xì)菌比例不同, 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的豐度發(fā)生了顯著變化; 雌性和雄性蟹具有相同的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌, 且菌群豐度隨生長(zhǎng)階段發(fā)生的變化在雄蟹和雌蟹中顯示出一致的趨勢(shì)[13]。對(duì)蝦類腸道菌群的研究大多關(guān)注與疾病發(fā)生相關(guān)的微生物組成變化[14,15], 目前已有研究者對(duì)中國(guó)對(duì)蝦(Pe-naeus chinensis)、日本對(duì)蝦(Penaeus japonicus)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)和墨吉對(duì)蝦(Penaeus merguiensis)等蝦類早期發(fā)育階段的腸道菌群進(jìn)行了分離鑒定[16—19]。但關(guān)于克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)腸道菌群在不同性別和不同生長(zhǎng)階段之間的差異還未見(jiàn)報(bào)道。

克氏原螯蝦是一種淡水蝦類, 是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類之一[20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序的方法, 對(duì)自然環(huán)境中不同性別的克氏原螯蝦以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境下不同生長(zhǎng)階段的克氏原螯蝦腸道菌群組成及功能進(jìn)行了分析, 為克氏原螯蝦生長(zhǎng)過(guò)程中腸道益生菌的篩選及克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中益生菌制劑的研究提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 不同性別克氏原螯蝦腸道取樣

克氏原螯蝦樣品采集自湖北省武漢市蔡甸區(qū)武漢沃土清源稻蝦供養(yǎng)專業(yè)合作社(30.39°N,113.77°E)。取不同性別, 體長(zhǎng)約10.00 cm的克氏原螯蝦成蝦, 用75.0%的酒精進(jìn)行體表消毒, 在無(wú)菌環(huán)境下分離其后腸, 每3—4只蝦腸混成一個(gè)樣品, 保證每個(gè)樣品腸道中的內(nèi)容物共計(jì)不低于0.20 g, 其中雌性3個(gè)樣品, 雄性4個(gè)樣品, 置于無(wú)菌管中, 在-80℃下凍存。對(duì)克氏原螯蝦的處理嚴(yán)格遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和處理標(biāo)準(zhǔn)。用糞便基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取樣品微生物總DNA。

1.2 不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道取樣

克氏原螯蝦親本采集自武漢沃土清源稻蝦供養(yǎng)專業(yè)合作社。體表用高錳酸鉀浸泡消毒后, 置于經(jīng)高錳酸鉀消毒過(guò)的水族箱中暫養(yǎng)2周, 養(yǎng)殖密度為10只/箱, 雌雄性別比例為1∶1。養(yǎng)殖用水為經(jīng)過(guò)曝氣的自來(lái)水, 水深(5.00±1.00) cm, 水溫(25.00±1.00)℃, L∶D為12∶12, 投喂商業(yè)顆粒飼料(通威集團(tuán)生產(chǎn))。親蝦自然交配產(chǎn)卵, 幼蝦孵出后置于另外的水族箱中飼養(yǎng), 投喂飼料和飼養(yǎng)條件與成蝦相同。取體長(zhǎng)約2.00 cm的幼蝦(孵化后1個(gè)月)腸道(10只幼蝦腸道混為1個(gè)樣品)及體長(zhǎng)約27.00 cm的成蝦(3只成蝦腸道混為1個(gè)樣品), 置于無(wú)菌管中, 在-80℃下凍存。按1.1的方法提取總DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增條件和測(cè)序

對(duì)16S rRNA的V3—V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增(引物為341F: 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R: 5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。熱反應(yīng)條件為94.00℃變性5min; 94.00℃ 30s, 54.00℃ 30s,72.00℃ 30s的30個(gè)循環(huán); 最后在72.00℃下延長(zhǎng)10min。從1.2%瓊脂糖凝膠上切下PCR產(chǎn)物, 并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(AXYGEN, 美國(guó))純化。對(duì)每種純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基于Illumina的高通量測(cè)序(BGI, 中國(guó)深圳)。

1.4 生物信息分析

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾[21], 獲得Clean data。使用FLASH (Fast Length Adjustment of Short reads,v1.2.11)軟件, 利用reads 之間的重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成一條序列[22], 最小匹配長(zhǎng)度10 bp, 重疊區(qū)域允許錯(cuò)配率為0.1, 得到高變區(qū)的Tags; 利用USEARCH (v7.0.1090)軟件[23], 在97.0%的相似度下將Tags 聚類成OTU, 去除嵌合體,然后通過(guò)OTU 與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 對(duì)OTU 進(jìn)行物種注釋; 基于OTU 和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析及組間物種差異分析。

Alpha多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析[24], 包括Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)等。通過(guò)mothur (v1.31.2)軟件計(jì)算樣品的Alpha多樣性值, 用SPSS 22.0對(duì)Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent samplest-test)。

Beta多樣性分析是用來(lái)比較一對(duì)樣品在物種多樣性方面存在的差異大小, 包括Bray-Curtis距離、weighted UniFrac距離和unweighted UniFrac距離等。通過(guò)QIIME (v1.80)軟件分析各類群在樣品中的含量, 進(jìn)而計(jì)算出不同樣品間的Beta多樣性值。

2 結(jié)果

2.1 性別對(duì)克氏原螯蝦腸道菌群的影響

高通量測(cè)序的一般分析對(duì)2組克氏原螯蝦樣品(4個(gè)雄性樣本, 3個(gè)雌性樣本)的腸道微生物進(jìn)行測(cè)序, 去除低質(zhì)量序列后, 共獲得876639條序列,雄性腸道菌群高質(zhì)量序列在122100—133200, 雌性高質(zhì)量序列在123068—127654。對(duì)每個(gè)樣本獲得的序列按97.0%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分, 共得到2039個(gè)OTU。

用Alpha多樣性指數(shù)分析雌雄蝦腸道菌群多樣性的差異(表 1)。Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無(wú)顯著性差異, 表明雌雄克氏原螯蝦腸道菌群的Alpha多樣性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異。

表1 不同性別克氏原螯蝦腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 1 Alpha diversity index of intestinal microbiota in P. clarkii of different sexes (mean±SD)

腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 對(duì)OTU進(jìn)行物種分類并分別在門、綱、目、科、屬、種幾個(gè)分類等級(jí)對(duì)各個(gè)樣品作物種profiling面積圖和柱狀圖。在門水平上, 雌雄克氏原螯蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌群(相對(duì)豐度＞1.0%)組成較為一致,包括變形菌門Proteobacteria (27.3±12.8)%、厚壁菌門Firmicutes (25.7±14.1)%、軟壁菌門Tenericutes(18.8±13.7)%和擬桿菌門Bacteroidetes (18.3±17.3)%等, 各優(yōu)勢(shì)菌門在個(gè)體間豐度不同, 但不具有顯著性差異(圖 1)。

圖1 門水平上不同性別克氏原螯蝦腸道菌群組成Fig. 1 Composition of intestinal microbiota of P. clarkii of different sexes at the phylum level

在屬水平上, 除未能歸類的屬外, 雌雄克氏原螯蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌群的組成較為一致, 包括擬桿菌屬Bacteroides(11.8±14.0)%、希瓦氏菌屬Shewanella(6.8±6.5)%、梭菌屬Clostridium(4.8±7.7)%、厭氧桿菌屬Anaerorhabdus(3.8±5.3)%和檸檬酸桿菌屬Citrobacter(1.5±0.7)%等, 個(gè)體間相對(duì)豐度不同, 但不具有顯著性差異(圖 2)。

圖2 屬水平上不同性別克氏原螯蝦腸道菌群組成Fig. 2 Composition of intestinal microbiota of P. clarkii of different sexes at the genus level

腸道菌群Beta多樣性克氏原螯蝦腸道菌群基于Weighted_UniFrac多樣性距離、Unweighted_UniFrac多樣性距離及Bray_curtis多樣性距離的聚類熱圖分析都未顯示出根據(jù)性別進(jìn)行聚類的現(xiàn)象,在雌性和雄性的腸道菌群組成中并未表現(xiàn)出有規(guī)律的差異(圖 3)。

圖3 不同性別克氏原螯蝦腸道菌群Beta多樣性分析Fig. 3 Beta diversity analysis of intestinal microbiota of P. clarkii of different sexes

2.2 成蝦和幼蝦腸道菌群組成差異

高通量測(cè)序的一般分析在去除低質(zhì)量序列后, 從8個(gè)樣本中共分離到249813條序列, 對(duì)獲得的序列按97.0%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分, 共得到18186個(gè)OTU。

Alpha多樣性指數(shù)分析顯示(表 2), Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)有顯著性差異(P＜0.05), Simpson和Shannon指數(shù)沒(méi)有顯著性差異, 表明幼蝦的腸道菌群多樣性高于成蝦。

表2 不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 2 Alpha diversity index of intestinal microbiota in P. clarkii at different stages of growth (mean±SD)

腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)在門水平上, 幼蝦腸道中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)門有變形菌門(35.6%)、擬桿菌門(32.0%)、厚壁菌門(17.6%)、軟壁菌門(8.8%)和放線菌門(5.1%)。成蝦腸道中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)門有變形菌門(65.7%)、擬桿菌門(20.4%)、厚壁菌門(9.6%)、放線菌門(0.9%)和疣微菌門Verrucomicrobia (0.7%; 圖 4a)。雖然成蝦和幼蝦的優(yōu)勢(shì)菌群較為一致, 但Meta-stats分析顯示其豐度具有偏向性, 有顯著性差異的細(xì)菌門有13個(gè), 包括Thermi、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、衣原體門Chlamydiae、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、GN02、浮霉菌門Planctomycetes、變形菌門、SR1、軟壁菌門、TM7和疣微菌門(圖 4b)。

圖4 門水平上不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道菌群組成和差異Fig. 4 Intestinal microbial composition and differences of P. clarkii at different stages of growth at the phylum level

在屬水平上, 成蝦和幼蝦的腸道優(yōu)勢(shì)菌群組成差異較大, 在幼蝦腸道中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)屬有伯克氏菌目的一個(gè)未歸類屬Unclassified_Burkholderiales (21.1%)、氫噬胞菌屬Hydrogenophaga(7.6%)、黃桿菌屬Flavobacterium(7.4%)、叢毛單胞菌科的一個(gè)未歸類屬Unclassified_Comamonadaceae(5.4%)和嗜堿菌屬Alkaliphilus(5.2%); 成蝦腸道中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)屬有擬桿菌屬(12.5%)、黃桿菌屬(10.8%)、Paracoccus(9.1%)和毛螺菌科的一個(gè)未歸類屬Unclassified_Lachnospiraceae (5.5%; 圖5a)。Metastats分析顯示, 在屬水平上成蝦和幼蝦有顯著性差異的細(xì)菌屬有70個(gè), 前20位差異最大的細(xì)菌屬包括枝動(dòng)菌屬M(fèi)ycoplana、不黏柄菌屬Asticcacaulis、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas、嗜堿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬Novosphingobium、Methylopila、鞘脂菌屬Sphingobium、成對(duì)桿菌屬Dyadobacter、紅球菌屬Rhodococcus、氫噬胞菌屬Hydrogenophaga、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium、Tepidibacter、甲基醌菌屬Demequina、Kaistobacter、曲桿菌屬Ancylobacter、戴爾福特菌屬Delftia、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、Rheinheimera、Methyloversatilis和Sediminibacterium(圖 5b)。

圖5 屬水平上不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道菌群的組成和差異Fig. 5 Intestinal microbial composition and differences of P. clarkii at different stages of growth at the genus level

腸道菌群Beta多樣性PCA分析顯示出按照生長(zhǎng)階段, 即成蝦和幼蝦分別聚類的結(jié)果(圖 6a)。無(wú)論基于Unweighted_UniFrac距離還是Weighted_UniFrac距離的PCoA分析, 都顯示出明顯地根據(jù)生長(zhǎng)階段分別進(jìn)行聚類的結(jié)果(圖 6b和圖 6c)。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Adonis/PERMANOVA分析, 基于加權(quán)和未加權(quán)UniFrac距離的分析結(jié)果均顯示出成蝦和幼蝦腸道菌群有顯著差異(P＜0.05)。

圖6 不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道微生物的Beta多樣性分析Fig. 6 The β diversity analysis of intestinal microbiota in P. clarkii at different stages of growth

NMDS分析和UPGMA聚類分析也顯示出明顯的根據(jù)生長(zhǎng)階段進(jìn)行聚類的情況。進(jìn)一步對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Anosim分析, 基于加權(quán)和未加權(quán)UniFrac距離的分析結(jié)果均顯示出成蝦和幼蝦腸道菌群的顯著性差異(P＜0.05; 圖 7)。

圖7 不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道微生物的NMDS分析和UPGMA聚類分析Fig. 7 The NMDS and UPGMA clustering analysis of intestinal microbiota in P. clarkii at different stages of growth

成蝦和幼蝦腸道菌群的比較分析PLSDA分析顯示成蝦和幼蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)具有顯著性差異; 使用R軟件, 對(duì)豐度前50位的屬進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖, 結(jié)果也顯示出其腸道菌群根據(jù)生長(zhǎng)階段進(jìn)行聚類的情況(圖 8)。

圖8 不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道微生物的PLS-DA分析和熱圖Fig. 8 The PLS-DA and heatmap of intestinal microbiota in P. clarkii at different stages of growth

幼蝦和成蝦腸道菌群的功能預(yù)測(cè)在KEGG pathway database數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)幼蝦和成蝦的腸道菌群進(jìn)行PICRUSt功能預(yù)測(cè), 使用R軟件, 對(duì)豐度前50位的功能類群進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖(圖 9)。成蝦和幼蝦腸道菌群的主要功能包括細(xì)胞通訊、膜運(yùn)輸、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、遺傳信息復(fù)制和修復(fù)和能量代謝等, 2個(gè)生長(zhǎng)階段差異最顯著的功能有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝、異生素的生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

圖9 PICRUSt預(yù)測(cè)的不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道菌群功能的相對(duì)豐度Fig. 9 The relative abundance of the function of the intestinal microbiota predicted by PICRUSt in P. clarkii at different stages of growth

3 討論

對(duì)不同性別克氏原螯蝦腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn), 在野外蝦塘養(yǎng)殖下的克氏原螯蝦的腸道菌群不論是在群落多樣性、物種豐度還是菌群功能預(yù)測(cè)上, 都未體現(xiàn)出性別間的差異, 且腸道菌群的個(gè)體差異較大。對(duì)成蝦和幼蝦的腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn), 不同階段對(duì)腸道微生物的群落多樣性、豐度及功能都有顯著影響。

3.1 不同性別克氏原螯蝦腸道菌群的分析

有報(bào)道表明, 中華絨螯蟹雌雄個(gè)體的腸道菌群并無(wú)明顯差異, 具有相同的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌, 且菌群豐度隨生長(zhǎng)階段發(fā)生的變化在雄蟹和雌蟹中顯示出一致的趨勢(shì)[11]。在本實(shí)驗(yàn)中雌雄克氏原螯蝦腸道菌群的Alpha多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))均無(wú)顯著性差異。在物種組成和結(jié)構(gòu)上, 其擁有的優(yōu)勢(shì)菌群較為一致, 門水平上包括厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門等, 屬水平上包括擬桿菌屬、希瓦氏菌屬、梭菌屬和檸檬酸桿菌屬等,這些優(yōu)勢(shì)菌在成蝦腸道中趨于保守, 屬常駐菌群, 與南美白對(duì)蝦和黑虎蝦(Penaeus monodon)等結(jié)果相似[25—27]。

3.2 不同生長(zhǎng)階段克氏原螯蝦腸道菌群的分析

在羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn), 隨著養(yǎng)殖周期的推移, 其腸道菌群多樣性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì), 不同生長(zhǎng)階段的優(yōu)勢(shì)菌群組成也有所差異[28]。在本實(shí)驗(yàn)中克氏原螯蝦幼蝦的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著性高于成蝦(P＜0.05)。

在門水平的物種組成和結(jié)構(gòu)上, 兩個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌群較為一致, 包括變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門等。其中, 變形菌門是相對(duì)豐度最高的細(xì)菌門, 在許多動(dòng)物腸道中都屬常駐菌, 腸道微生物群落的失衡通常源于變形菌門豐度的變化,在變形菌門中有許多條件致病菌, 其在腸道內(nèi)的比例能夠反映微生態(tài)和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性, 是腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志[27]。擬桿菌門與碳水化合物的發(fā)酵相關(guān), 可以參與到膽汁酸以及類固醇的代謝中。擬桿菌門和厚壁菌門對(duì)發(fā)酵多糖都非常重要, 且兩者之間存在著一種相互促進(jìn)的共生關(guān)系, 它們共同促進(jìn)宿主吸收或儲(chǔ)存能量, 其比值的變化會(huì)影響機(jī)體內(nèi)腸道菌群的代謝潛力, 具有十分重要的意義。有研究表明患有肥胖癥的小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門較多, 擬桿菌門較少, 這種菌群結(jié)構(gòu)在分解食物和促進(jìn)宿主能量吸收方面的能力更強(qiáng)[30]。在本實(shí)驗(yàn)中幼蝦的比值為0.47 (F∶B=0.47), 成蝦比值為0.55 (F∶B=0.55), 顯示出成蝦更強(qiáng)的分解食物和吸收營(yíng)養(yǎng)的能力。

在屬水平上, 成蝦和幼蝦的優(yōu)勢(shì)菌群均包括黃桿菌屬、擬桿菌屬和氫噬胞菌屬, 是克氏原螯蝦的核心菌群。黃桿菌屬可以分解多糖, 擬桿菌的表面鞘脂的合成有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)[31], 且與氫噬胞菌屬一樣可以代謝氨基酸和碳水化合物,這些菌屬均在腸道代謝中扮演著重要作用[32]。成蝦和幼蝦有顯著性差異的細(xì)菌屬包括嗜堿菌屬、甲基醌菌屬、曲桿菌屬和紅球菌屬等。其中嗜堿菌屬在幼蝦中相對(duì)豐度較高, 是一類嚴(yán)格厭氧菌, 在自然界中常見(jiàn)于鹽度較高的水體中,而成蝦中相對(duì)豐度較高的甲基醌菌屬同樣是嗜堿菌, 可以分解代謝木聚糖。紅球菌屬是一種好氧的革蘭氏陽(yáng)性菌, 在成蝦腸道內(nèi)相對(duì)豐度較高。有研究表明有些紅球菌可以合成自由基清除劑參與機(jī)體的免疫防御機(jī)制[33], 大多數(shù)紅球菌則通過(guò)分泌多種消化酶參與宿主營(yíng)養(yǎng)代謝[34,35],廣泛存在于蝦蟹的腸道菌群中, 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

在對(duì)成蝦和幼蝦腸道菌群Beta多樣性的分析中, PCA分析、PCoA分析、多元方差分析、NMDS分析、UPGMA聚類分析和PLS-DA分析均顯示出不同生長(zhǎng)階段間腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)上的差異, 與鯉(Cyprinus carpio)等水生動(dòng)物的報(bào)道相似[36]。功能預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示, 幼蝦和成蝦腸道菌群差異較大的功能中, 成蝦腸道菌群的優(yōu)勢(shì)功能包括膜運(yùn)輸和碳水化合物代謝等, 幼蝦腸道菌群的優(yōu)勢(shì)功能包括細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、異生素的生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝等。由于成蝦A4樣品與鐵復(fù)合運(yùn)輸系統(tǒng)(Iron complex transport system)相關(guān)功能的相對(duì)豐度較高, 在聚類時(shí)與幼蝦聚為一支。

有作者報(bào)道, 莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)腸道正常菌群的建立是在其孵化后20—60d, 并推測(cè)其建立與腸道的結(jié)構(gòu)與功能的發(fā)育有關(guān)[37]。研究表明, 在克氏原螯蝦的養(yǎng)殖過(guò)程中, 從幼蝦發(fā)育為成蝦會(huì)由攝食浮游生物轉(zhuǎn)換為攝食顆粒飼料[38], 腸道內(nèi)多種消化酶表達(dá)增強(qiáng)[39]。為了適應(yīng)這種攝食習(xí)性的轉(zhuǎn)換, 克氏原螯蝦腸道菌群也會(huì)隨著消化系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能上的變化。