胡偉華 熊 陽 郭穩(wěn)杰 王宇宏 朱曉鳴 梅 潔

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidracoRichardson)是我國一種重要的淡水經(jīng)濟魚類, 育種技術(shù)的創(chuàng)新和新品種的培育推動了黃顙魚產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[1—5]。隨著黃顙魚“全雄1號”[6,7]和雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”[8]等水產(chǎn)新品種的推廣, 黃顙魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量呈現(xiàn)持續(xù)增長, 從2010年的18.43×107kg增長到2019年的53.69×107kg[9]。

近年來, 隨著黃顙魚產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展, 對苗種質(zhì)量要求也越來越高, 而苗種的好壞與母本的質(zhì)量緊密相關(guān)。目前黃顙魚生產(chǎn)過程中所使用的母本非?；祀s, 沒有經(jīng)過系統(tǒng)的選育和培育。由于普通黃顙魚經(jīng)濟效益低, 養(yǎng)殖戶多去養(yǎng)全雄或者雜交黃顙魚, 導(dǎo)致雌魚缺乏; 少數(shù)企業(yè)根據(jù)黃顙魚雌雄生長差異的現(xiàn)象, 把過篩所得的小的個體作為母本進行培育, 但其中混雜了20%—30%的雄性黃顙魚, 不僅浪費了親本培育飼料, 而且將生長快個體較大的母本過篩掉。楊天毅等[10]和Xiong等[11]利用魚類性逆轉(zhuǎn)技術(shù)結(jié)合黃顙魚性別連鎖分子標記成功將XX雌性黃顙魚逆轉(zhuǎn)為XX雄性黃顙魚, 然后XX雄性和雌性黃顙魚繁殖后獲得黃顙魚全雌配套系。黃顙魚全雌配套系還需要一個完善的母本培育模式進一步提升其繁殖性能, 充分發(fā)揮其作用, 實現(xiàn)黃顙魚“全雄1號”和雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”新品種的改良。

雜食性和肉食性魚類對碳水化合物利用率較低, 對脂肪消化率較高, 因此在雜食性和肉食性魚類飼料中, 脂肪常作為重要的能源物質(zhì)。同時, 脂肪是魚類必需脂肪酸的主要來源, 也是細胞的組成成分和代謝中不可缺少的物質(zhì)[12,13]。適宜的脂肪水平和均衡的脂肪酸組成對維持魚類的生長、發(fā)育和繁殖起著重要的作用[14]。已有關(guān)于黃顙魚和瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)的研究中, 蛋白質(zhì)、脂肪和糖類適宜的需求量或耐受能力結(jié)果差異較大, 蛋白質(zhì)適宜需求量在36%—45%[15,16], 對糖類的耐受能力可高至40%[17], 脂肪的需求量處于6%—11.31%[13,18,19]。近年來, 養(yǎng)殖戶為了片面追求生長速度和產(chǎn)量, 采取過度投喂而造成營養(yǎng)過剩,容易促進魚體脂肪含量增加。

目前對于黃顙魚的營養(yǎng)需求研究還不夠全面,缺乏完善的黃顙魚親本培育飼料。在黃顙魚養(yǎng)殖過程中大多使用的是膨化飼料, 淀粉是膨化飼料加工成型的關(guān)鍵成分[20], 過量投喂高糖高脂飼料容易造成黃顙魚腸系膜脂肪堆積和消化系統(tǒng)病變[16,18];而野生黃顙魚中不存在腸系膜脂肪堆積的現(xiàn)象。目前大多數(shù)黃顙魚苗種場所使用的親本都是從養(yǎng)殖的商品魚中挑選的, 存在腸系膜脂肪和內(nèi)臟脂肪堆積的問題, 容易造成種質(zhì)的嚴重退化進而影響苗種的質(zhì)量。在本研究中, 我們收集了3個不同地區(qū)苗種繁育場的雌性親本并追蹤分析母本飼養(yǎng)管理記錄, 通過與性成熟的野生雌性黃顙魚進行繁殖性能比較分析試驗, 旨在探索一套適合黃顙魚全雌配套系的母本培育方式, 提高苗種質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選擇3個不同黃顙魚苗種場(每個苗種場隨機挑選5尾雌魚解剖觀察內(nèi)臟脂肪沉積情況)及湖北省武漢市周邊自然湖泊中捕獲的性成熟雌性黃顙魚, 建立4個實驗?zāi)副救后w[平均體重(91.05±16.35) g, 每組50尾]。Group 1為野生黃顙魚;group 2為腸系膜脂肪較少的黃顙魚在繁殖前1個月進行強化培育, 培育方式如下: 將魚糜與甲魚料(粗蛋白含為46%、粗灰分為17%、 粗脂肪為4.0%和粗纖維為2.0%)進行混合, 第1周魚糜含量為10%, 第2至第3周魚糜含量為20%—25%, 第4周魚糜含量降為10%。group 3和group 4為腸系膜脂肪較多的2個黃顙魚養(yǎng)殖群體, 一直投喂黃顙魚商品膨化料(粗蛋白為42.2%、粗灰分為10.1%、粗脂肪為8.1%和粗纖維為2.6%)。試驗魚均放置于規(guī)格為2 m×2 m×1.5 m且在表面光滑的養(yǎng)殖池中, 水溫控制在23—26℃,晝夜充氧, 暫養(yǎng)48h后分別進行取樣和人工催產(chǎn)實驗。

1.2 形體指標測量及解剖觀察

每個群體隨機選取6尾進行取樣, 將實驗魚置于200 mg/L MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽)的環(huán)境中麻醉, 稱量體重(Body weight,BW), 取性腺和內(nèi)臟團, 用濾紙吸取流出的血液, 將完整卵巢和內(nèi)臟團置于解剖盤上, 拍照記錄。然后, 稱量性腺重(Gonad weight,GW)、完全剝離后腸系膜脂肪重量(Mesenteric fat weight,MFW), 計算性腺指數(shù)(Gonad somatic index,GSI)及腸系膜脂肪指數(shù)(Mesenteric fat index,MFI)。

1.3 冰凍切片油紅染色

將測量形體指標過程中取得的卵巢和肝臟組織置于4%多聚甲醛中固定48h, 用PBS(pH 7.2)沖洗2次, 30%蔗糖溶液(PBS配制)4℃浸透12h后,OCT包埋劑(Optimal cutting temperature compound)包埋, 用冰凍切片機連續(xù)切取4 μm厚度切片。60℃烤片30min, 然后用丙二醇梯度滲透處理, 0.5%油紅O染液常溫下染色2h后PBS沖洗, 100%丙二醇去背景色后PBS沖洗, 蘇木精染液復(fù)染10s, 清水沖洗吸干, 明膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.4 過碘酸-希夫染色(Periodic acid-Schiff, PAS)

將取得的肝臟置于4%多聚甲醛中固定48h; 逐級酒精脫水, 使用石蠟包埋劑包埋, 石蠟切片4 μm;蒸餾水洗滌1—2min, 用1%高碘酸水溶液氧化6—20min, 蒸餾水洗滌數(shù)次; 用Schiff試劑染色5—10min, 如果溫度低可適當(dāng)延長染色時間; 傾去Schiff 試劑, 在流水中沖洗, 直至流水顏色由紅色變?yōu)闊o色; 用Harri 蘇木素染液淺染細胞核2—3min,流水沖洗5—10min; 逐級酒精脫水, 二甲苯透明, 中性樹脂封固; 在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài),細胞核為藍色, 糖原為深紫色, 并拍照保存。

1.5 血清激素和蛋白水平檢測

在人工催產(chǎn)前, 每個群體隨機選取3尾黃顙魚,用1 mL注射器從尾部取血, 離心收集血清。分別采用江蘇博深生物科技有限公司生產(chǎn)的魚促黃體生成素(Luteinizing hormone, LH)Elisa試劑盒(BSE17501O2)和魚卵黃蛋白原(Vitellogenin, VTG)Elisa試劑盒(BS-E17403O2), 測定血清中LH和VTG含量。

1.6 人工繁殖

隨機挑選活力良好、無傷病、重量相近且性腺成熟好的雌魚, 6尾為一組, 每個群體選3組; 選取3條生殖器末端凸起較尖, 有明顯紅點的雄性黃顙魚。

催產(chǎn)方式: 催產(chǎn)藥物為地歐酮(DOM)、魚用絨毛膜促性腺激素(HCG)和促黃體激素釋放激素(LRH-A2)3種藥物配伍。雌魚采取2針法注射(胸鰭基部注射), 劑量分別為: 第一針, LHRH-A2 12 μg/kg+HCG 150 IU/kg; 第二針, LHRH-A2 18 μg/kg+HCG 1500 IU/kg+DOM 8 mg/kg, 2針間距時間為12h。雄魚只注射第二針, 且劑量減半[9]。

采用“半干法”進行黃顙魚人工授精, 達到效應(yīng)時間前2—3h檢查親魚狀態(tài), 待60%—70%的雌性黃顙魚個體都能達到順利排卵的時候, 開始人工擠卵。在卵收集完成后, 稱取產(chǎn)卵重量(Oviposition weight,OW), 計算產(chǎn)卵率(Spawning rate,SR); 用已經(jīng)準備好的3條健康雄性黃顙魚的混合精液, 進行人工授精。

黃顙魚受精卵置于玻璃平皿中充氣孵化。受精卵發(fā)育至原腸胚期后計算卵的總數(shù)和受精卵數(shù)量以及計算受精率(Fertilization rate,FR)。然后繼續(xù)充氣孵化, 統(tǒng)計孵化出苗數(shù)量。待出膜的魚苗發(fā)育至可平游時(96 hpf), 統(tǒng)計魚苗畸形率(Malformation rate,MR)。當(dāng)魚苗能主動開口攝食, 由內(nèi)源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)為混合營養(yǎng)時(144 hpf), 統(tǒng)計魚苗數(shù)量, 計算每尾母魚的出苗數(shù)量(Number of fry produced per female)。

1.7 結(jié)果統(tǒng)計及處理

腸系膜脂肪指數(shù)(MFI)=腸系膜脂肪重/體重×100

性腺指數(shù)(GSI)=性腺重/體重×100

產(chǎn)卵率(SR, %)=產(chǎn)卵重量/卵巢重×100

受精率(FR, %)=受精卵數(shù)/總卵數(shù)×100

畸形率(MR, %)=畸形苗數(shù)量/孵化出苗數(shù)量×100

單尾母魚出苗量=出苗數(shù)量/產(chǎn)卵親本尾數(shù)

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析, 采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行各組數(shù)據(jù)的組間差異分析,P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃顙魚母本腸系膜脂肪指數(shù)和性腺指數(shù)分析

通過解剖測量, 比較野生群體 (group 1)和3個養(yǎng)殖群體(group 2—4)母本腸系膜脂肪沉積及性腺發(fā)育情況 (圖 1A)。野生黃顙魚腸系膜脂肪指數(shù)(MFI)為(0.56±0.17)%, 在養(yǎng)殖群體中g(shù)roup 2—4分別為(1.97±0.40)%、(5.92±1.85)%和(9.62±1.01)%(圖 1B)。在性腺指數(shù) (GSI)上, 野生群體為(14.24±3.21)%, 養(yǎng)殖群體group 2—4分別為(17.95±2.97)%、(10.91±2.56)%和(9.69±2.88)%。野生群體的GSI稍微低于養(yǎng)殖群體group 2, 而group 2的GSI顯著高于group 3和4(圖 1C)。在人工培育群體中, group 2—4的MFI逐漸升高, 而GSI呈下降趨勢(group 3和4由于MFI過高,GSI差異不顯著), 故總體上MFI與GSI呈負相關(guān)。

圖1 四組母本黃顙魚的內(nèi)臟解剖圖、腸系膜脂肪指數(shù)和性腺指數(shù)Fig. 1 The anatomy, mesenteric fat index and gonadosomatic index of female yellow catfish in four groups

2.2 卵巢和肝臟組織學(xué)分析

肝臟油紅染色結(jié)果顯示, 腸系膜脂肪沉積較少的group 1在肝臟中的油脂滴沉積也較少, 而腸系膜脂肪沉積較多的群體group 3和group 4中, 肝臟中油脂沉積量也隨之增加, 腸系膜脂肪與肝臟脂肪含量存在相關(guān)性(圖 2)。

圖2 肝臟油紅染色組織切片分析Fig. 2 The oil red staining results of liver in these four groups of yellow catfish

肝臟糖原染色結(jié)果如圖 3所示, 在group 1和group 2中, 肝臟細胞排列整齊且無糖原沉積, 而在group 3和group 4中, 存在顯著糖原沉積, 且細胞出現(xiàn)空泡狀, 存在炎癥現(xiàn)象。

圖3 PAS染色比較分析肝臟組織的糖原含量Fig. 3 PAS staining showing the glycogen content in the liver tissue of four groups of yellow catfish

為了進一步研究脂肪對卵巢發(fā)育的影響的規(guī)律, 對4個群體中催產(chǎn)前的卵巢進行油紅染色和圖片梯度可視化分析。發(fā)現(xiàn)腸系膜脂肪沉積較少的野生群體group 1在卵子中油脂沉積也較少, 在人工培育群體中, 繁殖性能接近野生的群體group 2, 在卵巢中脂肪的沉積量與野生群體接近。而在腸系膜脂肪沉積較多的群體group 3和group 4中, 卵巢油脂沉積量也隨之增加(圖 4)。

圖4 各群體卵巢油紅染色組織切片F(xiàn)ig. 4 The oil red staining results of ovaries in these four groups of yellow catfish

2.3 人工繁殖結(jié)果差異分析

人工繁殖結(jié)果表明, 野生群體的產(chǎn)卵比[(66.54±12.43)%]與脂肪含量較少的group 2[(63.83±12.03)%]無顯著性差異, 但顯著高于脂肪含量較高的group 3[(48.56±10.04)%]和group 4[(42.21±8.68)%; 圖 5A]。同樣地, 受精率隨脂肪含量的升高而降低; group 1的受精率[(76.70±3.76)%]與group 2[(77.23±4.76)%]無顯著差異(P＞0.05), 但顯著高于group 3[(69.02±3.38)%]和group 4[(55.13±5.43)%; 圖 5B]。

圖5 四個母本群體人工繁殖的產(chǎn)卵比和受精率情況Fig. 5 The spawning rate and fertilization rate of the four female groups

2.4 苗種畸形分類、畸形率及出苗量統(tǒng)計分析

為了更好地評估腸系膜脂肪沉積對苗種的影響, 我們統(tǒng)計了苗種的畸形率和出苗量, 并對其畸形表型進行分類。根據(jù)觀察結(jié)果, 畸形苗種的表型主要有心包水腫、脊椎畸形和斷尾, 有些畸形苗種表現(xiàn)出一種表型, 有些則同時表現(xiàn)出兩種或者三種表型(圖 6)。

圖6 96 hpf黃顙魚畸形苗種的種類Fig. 6 The types of malformation in 96 hpf yellow catfish

統(tǒng)計分析結(jié)果表明黃顙魚苗種畸形率隨著母本腸系膜脂肪沉積增多而顯著增多(圖 7A)。我們選取魚苗開口攝食, 內(nèi)源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)為混合營養(yǎng)階段(144 hpf), 進行魚苗數(shù)量統(tǒng)計, 計算每尾親本出苗量。結(jié)果顯示, 野生群體出苗量與動物蛋白投喂組無明顯差異, 顯著高于膨化料投喂群體。結(jié)合畸形率和出苗量, 畸形苗在轉(zhuǎn)食階段出現(xiàn)死亡, 從而造成畸形率與出苗量呈負相關(guān), 同時, 隨著腸系膜脂肪沉積增多, 畸形率增高, 出苗量降低(圖 7B)。

圖7 四個群體人工繁殖的苗種畸形率和單尾魚出苗量Fig. 7 The malformation rate and number of fry produced per female in these four groups

2.5 母本激素水平分析

黃顙魚血清中促黃體生成素(LH)和卵黃蛋白原(VTG)水平的測量結(jié)果表明: group 1與group 2的LH水平無明顯差異(P＞0.05), 而group 3和group 4相較于前兩組顯著降低(P＜0.05; 圖 8A)。在VTG水平上, group 1和2無明顯差異(P＞0.05), group 3和group 4顯著低于前兩組(P＜0.05), 且group 4的VTG含量最低(圖 8B)。

圖8 母本血清中促黃體生成素和卵黃蛋白濃度Fig. 8 The concentrations of LH and VTG in four groups of females

3 討論

目前, 一些黃顙魚苗種場忽視親本培育, 在親本培育過程中不合理或過量地投喂成魚配合飼料,致使培育出的母本普遍存在腸系膜脂肪沉積的現(xiàn)象。本研究系統(tǒng)評價了腸系膜脂肪沉積與黃顙魚繁育性能的關(guān)聯(lián), 腸系膜脂肪過度沉積的黃顙魚母本繁殖性能明顯下降, 生產(chǎn)出來的苗種質(zhì)量欠佳;而使用腸系膜脂肪較少的黃顙魚, 在繁殖前1個月用動物性蛋白餌料進行強化培育能夠顯著改善繁殖性能和提高苗種質(zhì)量。

脂類在魚類生命代謝過程中具有多種生理功能, 在飼料中添加適量脂類, 能節(jié)約蛋白質(zhì), 提高飼料蛋白的利用率[21]。魚類缺乏皮下脂肪層, 脂肪主要蓄積在腸系膜脂肪組織、肝臟及肌肉[13]。蛋白、脂肪和糖類等營養(yǎng)物質(zhì)攝入過量, 容易在魚體形成大量的脂肪沉積成為體脂, 引起機體代謝紊亂,造成抗病力降低, 嚴重危害魚類的生長和健康[22]。其中腸系膜脂肪沉積重量占魚體的質(zhì)量比例與攝入量密切相關(guān)。當(dāng)脂肪沉積超過正常肝脂積累量時, 則表現(xiàn)為出魚類脂肪肝[23], 甚至產(chǎn)生脂毒性[24]。在本研究中, 腸系膜脂肪沉積量高的群體group 3和4的肝臟脂質(zhì)和糖原積累顯著高于野生群體group 1和腸系膜脂肪沉積量低的群體group 2(圖 2和圖 3)。

在動物中, 脂肪過度積累會嚴重影響雌性的繁殖性能; 在母豬妊娠期肥胖研究中發(fā)現(xiàn), 母豬背膘大于24 mm時候, 過度積累的脂肪, 會促進胎盤組織脂質(zhì)毒性環(huán)境發(fā)生, 致使氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)加劇, 造成弱仔(Low Birth Weight, LBW)比例增加[24]。肝臟能夠合成卵黃源蛋白等高密度脂蛋白及為卵發(fā)育提供能量的中性脂油滴, 其轉(zhuǎn)運至卵巢并調(diào)控卵巢的發(fā)育[25,26]。在Mansour等[27]研究中發(fā)現(xiàn)脂滴均勻分布的卵為好卵, 受精率較高, 而脂滴均勻成塊、大面積分布的卵為壞卵, 受精卵低或無法受精。在本研究中, group 1和2中脂質(zhì)均勻分布在卵母細胞中, 而group 3和4中脂質(zhì)成塊堆積在卵母細胞中(圖 4), 表明group 1和2的卵巢和卵子質(zhì)量比group 3和4好; 因此, group 1和2的產(chǎn)卵比、受精率和出苗量高, 且畸形率低(圖 5—7)。脂肪過度積累甚至還會隔代遺傳影響動物子代胚胎質(zhì)量和代謝功能, 在連續(xù)16周高脂投喂的小鼠模型中, 其卵子質(zhì)量、排卵率和子代胚胎發(fā)育均比正常投喂組差[28,29];高糖高脂飲食導(dǎo)致肥胖會損傷小鼠的卵子質(zhì)量, 這種影響甚至?xí)掷m(xù)三代[30]。

在人類中, 越來越多的研究表明, 肥胖會對女性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響, 引起生育能力下降及性激素的缺乏[31]。促黃體生成素(LH)是由腺垂體細胞分泌的一種促性腺激素, 可促進膽固醇在性腺細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成性激素。在肥胖女性中, LH激素水平顯著低于正常體重女性[32,33]。在魚類卵巢中, LH與FSH共同作用, 促進卵泡分泌甾體激素, 觸發(fā)排卵[34]。卵黃蛋白原(Vitellogenin, VTG)是進行卵黃合成的重要物質(zhì), 是魚類生殖過程中重要的生殖蛋白[35]。VTG在肝臟中合成, 后隨血液循環(huán)進入卵母細胞,在卵母細胞發(fā)育過程中水解為卵黃蛋白[36], 可為將來胚胎生長發(fā)育提供必需的營養(yǎng)。在爪蟾中,VTG能轉(zhuǎn)運Zn2+, Zn2+對胚胎發(fā)育非常重要, 缺乏會導(dǎo)致胚胎器官畸形[37]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 脂肪高的群體group 3和group 4血清LH和 VTG水平顯著低于脂肪低的野生群體和group 2(圖 8)。此外, 脂肪過度沉積的母本在注射催產(chǎn)藥物后, 會發(fā)生排卵不完全甚至不排卵, 從而導(dǎo)致母魚大量死亡, 這在很大程度上影響了黃顙魚苗種生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展[38, 39]。

綜上所述, 黃顙魚母本脂肪過度沉積會影響卵子和苗種質(zhì)量, 而腸系膜脂肪指數(shù)(MFI)可以作為一個很好的脂肪含量指示參數(shù)。在黃顙魚等雜食性和肉食性魚類的親本培育過程中, 不能按照傳統(tǒng)的商品魚養(yǎng)殖方式, 要制定一套合理的親本培育操作規(guī)范; 只有深入研究和了解親本的營養(yǎng)需求, 合理投喂減少腸系膜脂肪沉積, 改善繁殖性能, 才能生產(chǎn)出高質(zhì)量的苗種。