楊雅茹，李帥東，白 林，姜冬梅

（1.宜賓學院，四川 宜賓 644000；2.宜賓職業(yè)技術(shù)學院，四川 宜賓 644000；3.四川農(nóng)業(yè)大學，四川 雅安 625000）

本研究利用上流式厭氧污泥床（UASB）處理來自豬場的高濃度有機廢水，探究其啟動運行性能和微生物在UASB 反應器不同高度的分布情況，以期為UASB的性能優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 UASB 反應器裝置 UASB 反應器由直徑為0.2 m的圓柱體有機玻璃構(gòu)成，上部為三相分離器和出水口，底部進水，反應器總高度為1.4 m，從三相分離器下端到反應器底部從上到下均勻分布四個取樣口A、B、C、D，兩個取樣口之間相隔0.25 m，有效體積36 L。

1.2 啟動運行控制 本試驗水質(zhì)為豬場廢水，取自四川農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)豬場，化學需氧量（COD）達到8 000～10 000 mg∕L，pH 值為6.8～7.8；接種污泥為四川農(nóng)業(yè)大學污水處理廠ABR 反應器排出的厭氧污泥，污泥量占反應器總體積的21%。

UASB 啟動方案：在常溫下（20～30 ℃）采用連續(xù)進水的方式，初始進水流量設置為18 L∕d，流量設置及對應的水力停留時間（HRT）如表1 所示。在第一個水力停留時間，進水濃度不斷升高，直至升到6 000 mg∕L。出水濃度和去除率達到穩(wěn)定后，提高進水流量為28.8 L∕d，進入HRT2階段，出水濃度COD再次穩(wěn)定后，繼續(xù)減少HRT，使之達到設計水流量72 L∕d。每日定時監(jiān)測出水pH值，保證其在7.2～7.8之間。

表1 不同進水流量對應的水力停留時間（HRT）

1.3 不同高度污水、污泥樣品的采集 在每個HRT 對反應器從上到下O、A、B、C、D、I 六個取樣口的污水（含污泥）取樣，樣品置于高溫滅菌的聚乙烯瓶中，冰上保存并及時運送至實驗室。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 廢水水質(zhì)指標 檢測方法主要依據(jù)中華人民共和國國家標準測定法及《水和廢水監(jiān)測分析方法》。本研究主要檢測的水質(zhì)指標及方法見表2。

表2 水質(zhì)監(jiān)測指標及方法

1.4.2 16S rDNA 測序 利用提取污泥和廢水的DNA 試劑盒對樣品進行DNA 提取，將廢水、污泥樣品總DNA通過Illumina Miseq技術(shù)測序平臺對16S rDNA V4區(qū)的PCR產(chǎn)物進行高通量測序。

1.5 微生物測序結(jié)果分析 使用QIIME1.8.0 軟件過濾測序數(shù)據(jù)。通過Flash軟件將有Overlap的一對Reads 進行拼接，并對其數(shù)目進行統(tǒng)計。根據(jù)97%相似性使用Uclust 軟件對序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），代表是一組來源于某一個相同分類單元的序列。從同一OTUs 中取一條代表性序列，使用RDP Classifier進行下游的物種注釋分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 UASB 啟動及運行 反應器共運行了96 d，整個試驗過程COD去除情況見圖1。在水力停留時間為48 h（HRT1）階段，隨著進水COD 濃度升高，出水口的COD 濃度緩緩降低，最低COD 濃度為336 mg∕L，COD 去除率最高能達到89.58%，此時的容積負荷從0.16 kgCOD∕m3·d 升高到1.4 kgCOD∕m3·d，這樣以高頻小幅的方式提升，可縮短調(diào)試期。

在水力停留時間為30 h、24 h和12 h（HRT 2、HRT3和HRT4）階段，進水濃度維持在6 000 mg∕L左右時，每個HRT 的出水COD 呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，最終趨于穩(wěn)定。經(jīng)過4 個HRT 的運行，COD去除率最終能達到80%以上。

沼氣產(chǎn)率如圖1 所示。在整個啟動階段，沼氣產(chǎn)率一共有四個波峰，分別對應四個運行階段。在第一個階段，隨著反應器運行，沼氣產(chǎn)率不斷升高，最高升到了0.886 4 L∕L·d，但是當HRT降低為30 h時，最高產(chǎn)率只有0.418 4 L∕L·d；后兩個HRT 階段的沼氣最高產(chǎn)率又恢復到0.9 L∕L·d左右，分別為0.890 1 L∕L·d、0.899 8 L∕L·d。說明在第二階段的時候，反應器正在適應高濃度的COD，因此可以推測當反應器從固定HRT、升高濃度進水變?yōu)楸３止潭ǜ邼舛冗M水、降低HRT這個轉(zhuǎn)變過程會影響沼氣產(chǎn)率。

圖1 UASB反應器啟動期間進水COD、出水COD和產(chǎn)氣率

啟動中后期，容積負荷變化范圍為2.62～10.95 kgCOD∕m3·d。本次試驗中，用UASB處理常溫下的豬場廢水，最高容積負荷和產(chǎn)氣率都較高，表明反應器不同的設計參數(shù)和運行情況會影響產(chǎn)氣率。

2.2 UASB 啟動階段反應器不同高度微生物群落的變化分析

2.2.1 微生物群落豐富度和多樣性分析 根據(jù)97%相似性聚類成的OTU數(shù)目和Alpha多樣性分析結(jié)果來看（見圖2），發(fā)現(xiàn)在UASB啟動期間的每個HRT 階段，微生物群落的豐富度指數(shù)（Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon）會沿著反應器高度呈現(xiàn)不同的差異性［1］。HRT1階段，微生物群落豐富度表現(xiàn)為中下部＞頂部＞中上部＞底部（C1＞A1＞B1＞D1）；微生物多樣性則表現(xiàn)為中上部＞頂部＞中下部＞底部（B1＞A1＞C1＞D1）。當縮短水力停留時間為30 h（HRT2階段）時，微生物群落豐富度沿著UASB 反應器高度增加而下降；微生物多樣性表現(xiàn)為底部最高，中下部最低。HRT3 階段，微生物群落豐富度變化趨勢為頂部＞中下部＞中上部＞底部（A3＞C3＞B3＞D3）；微生物多樣性沿著反應器高度增加而升高。HRT4 階段，微生物群落的豐富度指數(shù)表現(xiàn)為中下部＞中上部＞頂部＞底部（C4＞B4＞A4＞D4）；多樣性指數(shù)和HRT3階段的變化趨勢一致。

圖2 OTU、Chao1和Shannon統(tǒng)計圖

2.2.2 物種注釋分析 采用RDP Classfier 對每一條OUTs的一條代表性序列進行下游物種注釋分析，共得到60 個門、133 個綱、233 個目、253 個科、590 個屬水平的細菌和一些無法歸類的細菌。利用UASB 反應器處理豬場廢水時，不同啟動階段優(yōu)勢菌群在門水平上是相似的，分別為屬于古菌的廣古菌門（Euryarchaeota）和屬于細菌的擬桿菌（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Fimicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、陰溝單胞菌門（WWE1），屬水平上為甲烷絲菌屬（Methanosaeta）、擬桿菌目（Bacteroidales）和互養(yǎng)菌屬（Syntrophus），但占細菌總數(shù)的百分比不同。在細菌16S rRNA測序中發(fā)現(xiàn)了古菌，這是由于細菌和古菌在此基因序列上有較高的同源性［2］。

本試驗中廣古菌門（Euryarchaeota）啟動初期就是優(yōu)勢菌，與徐銳［3］的研究不一致，可能是因為接種污泥自身就帶有Euryarchaeota。Euryarchaeota的甲烷絲菌屬（Methanosaeta）在屬水平上也是反應器的優(yōu)勢菌，Methanosaeta是專性乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，可利用多種代謝底物產(chǎn)生甲烷（如乙酸、氫氣∕二氧化碳），適于生活在高負荷和中性pH 條件下［4］。在啟動時期不同HRT 下，Methanosaeta的豐度沿著反應器的高度被量化，在前三個HRT 下，其最高值都位于反應器中下部，只有在啟動末期沿反應器高度自下而上呈現(xiàn)降低趨勢。乙酸型產(chǎn)甲烷古菌的生長與顆粒生物膜密切相關，啟動末期底部最高，說明大部分顆粒污泥都集中在底層，若顆粒退化，其生物豐度也會降低［5］。

啟動初期和末期，擬桿菌（Bacteroidetes）都集中在中上部和頂部，啟動中期會有一段時間集中在反應器底部（如HRT2）。Bacteroidetes的擬桿菌目（Bacteroidales）在目水平上是優(yōu)勢菌，在UASB反應器不同高度的豐度變化趨勢和Bacteroidetes一致，只有在啟動中后期依然保持底部較高水平，表明Bacteroidales在降解反應器有機底物（如蛋白質(zhì)和多糖）中起到了非常關鍵的作用，可為甲烷的產(chǎn)生提供更多的底物［6］。

有研究表明變形菌門（Proteobacteria）在去除有機物中起了非常重要的作用［7-8］，主要參與消耗乙酸、丙酸和丁酸等有機酸，若Proteobacteria量少，有機酸產(chǎn)生量可能也會少。在啟動初期，Proteobacteria主要在反應器頂部聚集，在中后期直至末期，反應器不同高度的Proteobacteria都沒有較明顯的差異，表明厭氧反應器在啟動初期產(chǎn)生有機酸的位置可能是在反應器頂部。在啟動中后期，Proteobacteria的量遠遠低于啟動的其他時期，我們猜想有可能在啟動中后期會有一段產(chǎn)酸的抑制時期。Proteobacteria在屬水平上的互養(yǎng)菌屬（Syntrophus）是啟動期反應器的優(yōu)勢菌，對產(chǎn)甲烷能力的提升有重要作用。有研究表明，Syntrophus是具有直接種間電子傳遞能力的細菌之一，可以提升厭氧反應器中有機物轉(zhuǎn)化成甲烷的速率［9］。在反應器啟動初期和末期，Syntrophus集中在底部，沿反應器高度增加量逐漸減少，表明啟動初期和末期主要是底部的Syntrophus在進行種間電子傳遞，從而提高產(chǎn)甲烷的速率。啟動中期，不僅反應器不同高度Syntrophus的量沒有明顯差異，而且Syntrophus的總量也低于啟動前期和后期，表明啟動中期Syntrophus產(chǎn)甲烷速率可能有所降低，這也與本試驗中啟動中期（HRT2）產(chǎn)氣能力下降一致。但啟動中后期產(chǎn)甲烷能力是非常高的，表明在啟動中后期對產(chǎn)甲烷能力起主要作用的菌不是Syntrophus，而是其他細菌或（和）古菌。

厚壁菌門（Fimicutes）是一種細胞壁較厚的細菌，其肽聚糖可以通過產(chǎn)生內(nèi)孢子抵抗極端環(huán)境，因此對高有機負荷環(huán)境具有高耐受性［10］。豬場廢水恰好屬于高有機負荷的廢水，因此，F(xiàn)imicutes屬于反應器中的第三優(yōu)勢菌。Fimicutes在反應器不同高度的量會隨著啟動階段的不同表現(xiàn)出一定的差異。在啟動初期和末期，反應器不同高度的Fimicutes量沒有明顯差異，但啟動中后期在反應器頂部，F(xiàn)imicutes的量增加。有研究證明Fimicutes的變化趨勢與甲烷產(chǎn)量呈現(xiàn)正相關，因其極有可能會降解蛋白質(zhì)、多糖或腐殖酸［6］。本試驗啟動中后期（HRT3），F(xiàn)imicutes的量高于前面幾個階段，和產(chǎn)甲烷量最多一致，表明此階段Fimicutes最重要的一個功能有可能就是產(chǎn)甲烷。但是微生物群體之間存在協(xié)同作用，若其中一些群體的功能失效，另外一些群體將補償該特定功能（代償性）［11］。因此，不排除Fimicutes有可能此時在補償某些產(chǎn)甲烷菌群的功能。

綠彎菌門（Chloroflexi）具有產(chǎn)生水解酶的功能，主要降解的是可溶性微生物產(chǎn)物，如可溶性蛋白和可溶性多糖等。在UASB 反應器中，Chloroflexi基本都集中在反應器底部，只有在啟動中期會有一段時間在反應器中上部，表明反應器中可溶性的微生物產(chǎn)物大部分位于反應器底部，顆粒污泥也是大部分位于反應器底部。陰溝單胞菌門（WWE1）是Chouari 在2005 年從城市污水處理廠發(fā)現(xiàn)并命名為候補門，后被重新命名為“Cloacimonetes”，其廣泛存在于豬的消化道以及厭氧反應器中［12］。本研究中WWE1 在啟動初期和末期，反應器底部的量高于中部和頂部，但這兩段啟動時期的總量都小于啟動中期。而啟動中期反應器不同高度的豐度有差異，啟動的中前期，WWE1 主要聚集在反應器中下部，頂部較少，啟動中后期，反應器不同高度的WWE1 量沒有明顯變化，但總量高于其余啟動時期。因此，推測WWE1可能是啟動中后期提升產(chǎn)甲烷能力的主要細菌。

3 結(jié)論

3.1 采用設計的UASB 處理豬場廢水，容積負荷從0.16 kgCOD∕m3·d 升高到1.4 kgCOD∕m3·d，設計的反應器可處理6 000 mg∕L COD濃度的糞水，產(chǎn)氣率最高能達到0.9 L∕L·d左右，COD去除率最高為89.58%。

3.2 UASB 反應器在啟動時期的不同高度，優(yōu)勢菌種類沒有變化，在門水平上為屬于古菌的廣古菌門和屬于細菌的擬桿菌、變形菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、陰溝單胞菌門，屬水平上為甲烷絲菌屬、擬桿菌目和互養(yǎng)菌屬。但優(yōu)勢菌會有量的差異：廣古菌門、綠彎菌門和陰溝單胞菌門主要位于反應器底部和中下部；擬桿菌、變形菌門、厚壁菌門主要位于反應器中部和上部；甲烷絲菌屬和互養(yǎng)菌屬主要位于反應器底部和中下部，擬桿菌目主要位于反應器中部和上部。