杜微波，張志強(qiáng)，萬瑩瑩，陳敬然，沈建梅

(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京101301)

茵陳蒿湯出自張仲景所著《傷寒論》[1]，主要由茵陳、大黃和梔子三種成分組成，功效為清熱祛濕、利膽退黃，用于治療濕熱黃疸?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿湯有利濕退黃、促進(jìn)膽紅素代謝、修復(fù)肝損傷等功效。

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局在《中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑簡(jiǎn)化注冊(cè)審批管理規(guī)定(征求意見稿)》[2]中明確指出，將經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)作為中藥藥用物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)古代典籍中記載的制備方法制備，經(jīng)方物質(zhì)基準(zhǔn)應(yīng)以主要藥效物質(zhì)為研究基礎(chǔ)，以確保經(jīng)方制劑與傳統(tǒng)中醫(yī)臨床所使用的質(zhì)量療效一致。因此如何建立經(jīng)方物質(zhì)基準(zhǔn)藥效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重點(diǎn)，也是開發(fā)經(jīng)方制劑的關(guān)鍵通路。

特征圖譜是通過反映中藥化學(xué)成分中某些重要的特征信息，進(jìn)而控制中藥質(zhì)量的研究方法，能夠確保其內(nèi)在質(zhì)量的均一、穩(wěn)定[3]。因此本研究根據(jù)各藥味在處方中的作用，針對(duì)各藥味關(guān)聯(lián)的藥效成分進(jìn)行目標(biāo)成分的選取，以期建立能夠真實(shí)、全面反映茵陳蒿湯藥效的特征圖譜，以評(píng)價(jià)經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量，為后續(xù)的藥物開發(fā)及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20A型液相色譜儀，安捷倫1260II型液相色譜儀，十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司BT25S)，萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司MS204TS/02)，千分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司SQP)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司 KQ-300DB)。

1.2 材料

沒食子酸(批號(hào)：110831-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度90.81%)，綠原酸(批號(hào)：110753-201617，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度91.8%)，秦皮乙素(批號(hào)：110741-201708，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.9%)，梔子苷(批號(hào)：110749-201718，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度97.6%)，金絲桃苷(批號(hào)：111521-201708，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度95.7%)，槲皮素(批號(hào)：100081-201610，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.1%)，大黃素(批號(hào)：110756-201512，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度98.7%)，蘆薈大黃素(批號(hào)：110795-201710，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度98.3%)，大黃酸(批號(hào)：110757-201607，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.3%)；乙腈(色譜純HPLC)，無水乙醇(分析純AR)，甲醇(分析純AR)，磷酸(色譜純HPLC)，蒸餾水；實(shí)驗(yàn)用飲片均在北京康仁堂藥業(yè)有限公司購(gòu)買，并經(jīng)過檢測(cè)符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 目標(biāo)物質(zhì)的選擇

茵陳蒿湯用于治療肝病的一個(gè)經(jīng)典名方，功效為清熱、利濕、退黃。其中君藥為茵陳，有清熱利濕、利膽退黃之功；臣藥為梔子，可泄熱退黃，清解三焦之熱；佐藥大黃，清利濕熱，泄熱通便，化瘀破結(jié)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿湯治療肝病的作用機(jī)制主要為修復(fù)肝損傷、抗肝纖維化、改善肝脂肪代謝、利膽等[4]。

君藥茵陳主要的化學(xué)成分有香豆素、黃酮、有機(jī)酸類等。其中有研究表明香豆素類與茵陳保肝作用相關(guān)，可以抑制因四氯化碳引起的肝體比的上升，以及阻止血中丙二醛形成及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移平的升高，具有抗脂質(zhì)過氧化的作用[5]；有機(jī)酸與茵陳清熱利濕、利膽作用相關(guān)，有明顯的抗病毒、保肝利膽等作用[6-7]。

臣藥梔子主要成分為環(huán)烯醚萜苷類[8]，其中梔子苷存在較強(qiáng)的藥理活性。孫旭群等[9]研究表明：梔子苷與梔子的利膽退黃作用相關(guān)，能顯著增加6 h內(nèi)正常大鼠和肝損傷大鼠的膽汁排泌量，在0.2～1.6 g范圍內(nèi)其利膽作用的差異顯著，尤其在是給藥2 h和肝損傷模型中表現(xiàn)更為明顯。

佐藥大黃含有蒽衍生物類、有機(jī)酸類、黃酮類及其苷類化合物和鞣質(zhì)類等多種有效成分。研究表明蒽醌類具有保肝降酶作用，通過抑制四氯化碳所致的總蛋白、白蛋白的下降及急性肝損傷小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的升高[10]，與大黃保肝作用相關(guān)；鞣質(zhì)則具有較好的自由基活性氧的功能，與大黃瀉熱通便作用相關(guān)[11]；黃酮類成分與大黃利濕、保肝作用相關(guān)，可降低尿中白蛋白量，對(duì)腎病理組織學(xué)病變亦有明顯改善作用，降低模型大鼠血清中葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、三酰甘油和總膽固醇含量[12]，并對(duì)四氯化碳肝損傷的小鼠具有良好的保肝降酶作用。

根據(jù)對(duì)各藥味的藥理學(xué)作用結(jié)合茵陳蒿湯中藥味功效及作用機(jī)制，確定對(duì)茵陳中香豆素類及有機(jī)酸、梔子中環(huán)烯醚萜苷類、大黃中蒽醌類、黃酮類及鞣質(zhì)成分進(jìn)行特征圖譜研究，根據(jù)特征圖譜技術(shù)要求，采用HPLC法建立茵陳蒿湯基準(zhǔn)物質(zhì)的特征圖譜，以保證能夠全面反映茵陳蒿湯的功效特點(diǎn)。

2.2 色譜條件的選擇

茵陳蒿湯成分中蒽醌類多為小極性成分，環(huán)烯醚萜、黃酮、香豆素類多為中極性成分，鞣質(zhì)、有機(jī)酸類多為大極性成分。因此針對(duì)特征圖譜目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，結(jié)合統(tǒng)計(jì)結(jié)果，確定流動(dòng)相及基本的梯度，進(jìn)行方法優(yōu)化，得到茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜色譜條件：Agilent-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱；檢測(cè)波：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05%(B)磷酸溶液。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 對(duì)茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)目標(biāo)物質(zhì)的極性情況分析可知，其中茵陳、梔子水溶性成分較多，大黃脂溶性成分稍多。分別以水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇作為提取溶媒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)30%乙醇特征圖譜的色譜峰信息較豐富，并能夠兼顧物質(zhì)基準(zhǔn)的各類目標(biāo)物質(zhì)，因此確定以30%乙醇作為提取溶媒。

采用30%乙醇作為提取溶媒，分別考察不同提取方式(熱回流提取、振搖提取、超聲提取)，在確定提取方式的基礎(chǔ)上對(duì)提取時(shí)間(15 min、30 min、45 min)進(jìn)行考察。由比較結(jié)果可知，三種不同方式以及提取時(shí)間獲得的特征圖譜信息差異不大，考慮到操作便利性以及為保證各類化學(xué)成分的提取充分，確定提取方式采用超聲，提取時(shí)間為30 min。

綜上，確定供試品溶液的制備方法為：取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 陰性溶液的制備 根據(jù)處方，分別制備缺少茵陳、梔子、大黃的樣品，按照茵陳蒿湯基準(zhǔn)物質(zhì)制備過程制備相應(yīng)的陰性樣品。取陰性樣品0.5 g，按“2.3.1”項(xiàng)下“供試品溶液制備方法”制備陰性溶液，即得。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 取沒食子酸、綠原酸、秦皮乙素、梔子苷、金絲桃苷、槲皮苷、大黃酸、大黃素對(duì)照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含60μg、40μg、50μg、80μg、100μg、50μg、70μg、70μg的溶液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”確定的供試品溶液制備方法和“2.2”確定的色譜條件進(jìn)行操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，以綠原酸峰為S峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于2%，表明儀器精密度良好。見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)粉末0.5 g(共6份)，精密稱定，按“2.3”確定的供試品溶液的制備方法和“2.2”確定的色譜條件進(jìn)行操作，以綠原酸峰為S峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于2%，說明本方法的重復(fù)性良好。見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”確定的供試品溶液的制備方法和“2.2”確定的色譜條件進(jìn)行操作，分別在制備后放置0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以綠原酸峰為S峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間。在24 h內(nèi)各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于2%，供試品溶液中化學(xué)成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 共有峰的確定及歸屬

2.5.1 共有峰的確定 測(cè)定15批茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012.1版本)，以1號(hào)為參照?qǐng)D譜，按中位數(shù)計(jì)算，進(jìn)行共有峰標(biāo)識(shí)，共獲得23個(gè)峰，見圖1。

圖1 共有峰標(biāo)識(shí)

2.5.2 共有峰歸屬 將陰性樣品與茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜相比較，并對(duì)峰進(jìn)行歸屬。其中12個(gè)峰歸屬為茵陳、2個(gè)峰歸屬為梔子、7個(gè)峰歸屬為大黃，其余為共有峰。見圖2。

注：(1)茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)；(2)大黃陰性樣品；(3)梔子陰性樣品；(4)茵陳陰性樣品。圖2 茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)歸屬峰結(jié)果

2.5.3 共有峰指認(rèn) 根據(jù)茵陳蒿湯中化學(xué)成分，確認(rèn)了8個(gè)特征峰，峰3為沒食子酸、峰4為綠原酸、峰6為秦皮乙素、峰8為梔子苷、峰13為金絲桃苷、峰20為槲皮素、峰22為大黃酸、峰23為大黃素，見圖3。

圖3 茵陳蒿湯基準(zhǔn)物質(zhì)峰指認(rèn)

2.6 特征峰選取及評(píng)價(jià)

結(jié)合茵陳蒿湯功效成分及峰的峰高、峰形等參數(shù)，選取了17個(gè)特征峰，見圖4。其中峰1、2、3、5、7、8、9、11、12、13共計(jì)10個(gè)色譜峰來自于茵陳，占總峰數(shù)約58.8%；其中峰4、6共計(jì)2個(gè)色譜峰來自于梔子，占總峰數(shù)約11.8%；其中峰8、10、14、15、16、17共計(jì)6個(gè)色譜峰來自于大黃(其中峰8與茵陳共有)，占總峰數(shù)約47.1%。

圖4 茵陳蒿湯基準(zhǔn)物質(zhì)特征圖譜

根據(jù)特征峰的分離及保留時(shí)間情況，確定以綠原酸所對(duì)應(yīng)的峰為S峰，并采用相對(duì)保留時(shí)間對(duì)茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，即：供試品特征圖譜應(yīng)呈現(xiàn)17個(gè)特征峰，與綠原酸峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±10%范圍之內(nèi)，規(guī)定值為0.49(峰1)、0.54(峰2)、1.07(峰4)、1.22(峰5)、1.66(峰6)、2.66(峰7)、2.91(峰8)、2.99(峰9)、3.29(峰10)、4.18(峰11)、4.29(峰12)、4.55(峰13)、5.16(峰14)、5.21(峰15)、5.63(峰16)、5.75(峰17)。

3 討論

本文研究根據(jù)茵陳蒿湯處方的功效及各味藥在處方中的作用，篩選出特征圖譜研究的主要目標(biāo)物質(zhì)，在色譜條件及供試品溶液制備方法的選擇時(shí)均對(duì)目標(biāo)物質(zhì)情況有針對(duì)性地進(jìn)行了考察，進(jìn)而建立了茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜。對(duì)峰進(jìn)行歸屬，12個(gè)峰歸屬為茵陳、2個(gè)峰歸屬為梔子、7個(gè)峰歸屬為大黃。根據(jù)《傷寒論》中記載，茵陳蒿湯處方為：茵陳六兩，梔子14枚，大黃二兩[1]。其中茵陳用量最大、大黃次之、梔子最少，說明本研究特征圖譜反映的成分?jǐn)?shù)量符合茵陳蒿湯方劑特性。

對(duì)茵陳蒿湯基準(zhǔn)物質(zhì)的峰進(jìn)行指認(rèn)，確定包含綠原酸、秦皮乙素、梔子苷、沒食子酸、大黃酸、大黃素、金絲桃苷、槲皮素等成分。其中茵陳主要的有機(jī)酸類成分為綠原酸，具有抗氧化、抗病毒、清除體內(nèi)自由基以及保肝利膽的作用[13-14]；茵陳主要的香豆素成分為秦皮乙素，能夠降低叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的肝臟病變的發(fā)生率，起到保肝作用[15]；梔子主要的環(huán)烯醚萜類成分為梔子苷，對(duì)四氯化碳引起的小鼠肝臟損傷具有顯著的保護(hù)作用，明顯抑制肝臟組織疤痕形成以及膠原沉積[9]；大黃主要的鞣質(zhì)類成分為沒食子酸，研究表明當(dāng)質(zhì)量濃度在50～400ug·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，具有明顯的清除一氧化氮、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基以及羥自由基的作用[16]；大黃主要的蒽醌類成分為大黃酸和大黃素[10]，具有瀉下作用，同時(shí)也可以降低因四氯化碳所導(dǎo)致的肝損害；大黃主要的黃酮類成分為金絲桃苷和槲皮素，金絲桃苷能通過上調(diào)細(xì)胞抗氧化酶活性，增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化能力，從而保護(hù)肝細(xì)胞因脂質(zhì)過氧化物而造成的損傷[17]，而槲皮素能夠改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織脂肪變性程度，減輕肝臟炎癥[18]。表明特征圖譜反映的成分與茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜目標(biāo)物質(zhì)的選擇設(shè)計(jì)相符。

《注冊(cè)管理規(guī)定》[2]中規(guī)定經(jīng)典名方制劑應(yīng)與其物質(zhì)基準(zhǔn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性一致，且經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)應(yīng)作為其復(fù)方制劑生產(chǎn)工藝路線制定、參數(shù)的優(yōu)化和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的參照。因此，制定特征圖譜方法能夠反映中藥經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的功效，是對(duì)經(jīng)典名方制劑減免藥效及臨床試驗(yàn)政策下臨床療效的保證。

本方法建立的茵陳蒿湯物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜能夠反映茵陳蒿湯藥效，可為后續(xù)關(guān)于茵陳蒿湯制劑的開發(fā)及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。