于小婷，張漫，鄢明華，王俊菊，姜淋潔，王猛，程雪嬌

摘要：參照《中華人民共和國獸藥典》2015版一部附錄1143細菌內(nèi)毒素檢查法的有關規(guī)定，對加米霉素注射液內(nèi)毒素限度及檢查方法進行了研究。結果顯示，加米霉素注射液通過調(diào)節(jié)pH并將供試品稀釋到498倍及以上時，對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾，內(nèi)毒素限值確定為0.83EU/mg。對3批產(chǎn)品進行檢查，結果均符合規(guī)定。因此，細菌內(nèi)毒素檢查方法（凝膠法）可用于加米霉素注射液的細菌內(nèi)毒素檢查。

關鍵詞：加米霉素注射液;內(nèi)毒素檢查;凝膠法

加米霉素[1，2]屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是由法國梅里亞公司研發(fā)的第二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的代表藥物之一，在獸醫(yī)臨床具有廣闊的應用前景。細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，可引起人和動物發(fā)熱[3，4]。藥品如果被細菌內(nèi)毒素污染會產(chǎn)生嚴重的安全問題，尤其是對身體機能較差的患病及幼齡動物。目前國內(nèi)已有數(shù)家獸藥企業(yè)進行了加米霉素注射液的研發(fā)和新獸藥申報，但不同廠家研發(fā)的加米霉素注射液處方、工藝不盡相同，這也決定了企業(yè)需根據(jù)自身產(chǎn)品的特點，建立相應的內(nèi)毒素檢查方法學。為保證加米霉素注射劑在使用過程中的安全性，本研究對加米霉素注射液細菌內(nèi)毒素檢查的可行性進行了方法學驗證，為該產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素的檢查提供依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 儀器

單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;

101型電熱鼓風干燥箱，北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司;

QL-861型旋渦混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;

DZKW-4恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司;

試驗所用玻璃器皿經(jīng)250℃烘烤1h以上。

1.2 藥品與試劑

細菌內(nèi)毒素工作標準品（批號：150601-201784，規(guī)格：80EU/支，中國食品藥品檢定研究院）細菌內(nèi)毒素檢查用水（批號：1807130，規(guī)格：5mL/支，湛江安度斯生物有限公司）鱟試劑（TAL）（批號：1706022，靈敏度：0.25EU/mL，規(guī)格：0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司）鱟試劑（TAL）（批號：1704203，靈敏度：0.25EU/mL，規(guī)格：0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司）Tris緩沖液（批號：1808240，規(guī)格：4mL/支，湛江安度斯生物有限公司）加米霉素注射液（批號：201801001，201801002，201801003，

202001001，202001002，202001003規(guī)格：150mg/mL，天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2015版附錄1143“細菌內(nèi)毒素檢查法”[5]，進行鱟試劑的標示靈敏度復核。結果見表1。結果顯示2種不同廠家的鱟試劑的復核靈敏度λc均在0.5～2.0λ之間，符合規(guī)定。

2.2 細菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式：L=K/M[6]，式中，M為每千克體重每小時最大劑量，本藥品的推薦劑量為6mg/kg·bw，一個療程僅用1次，確定M為6mg/（kg·h）;K為注射劑的致熱閾值K=5EU/（kg·h），則L=5EU/（kg·h）/6mg/（kg·h）=0.83EU/mg。為保障安全用藥，故將加米霉素注射液的內(nèi)毒素限值確定為0.83EU/mg。

2.3 加米霉素注射液最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)公式MVD=L×C/λ，其中L為加米霉素注射液的細菌內(nèi)毒素限值0.83EU/mg，濃度C為150mg/mL，λ為鱟試劑標示靈敏度，目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03EU/mL。則加米霉素注射液的對應最大有效稀釋倍數(shù)為：MVD 0.5～MVD 0.03分別為249、498、996、1，992和3，984倍。

2.4 干擾試驗預實驗

由于處方中含有一定濃度的丁二酸，經(jīng)測制劑pH為5.0左右，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0之間為宜，因此加米霉素注射液在稀釋過程中加入內(nèi)毒素檢查專用Tris緩沖液，使其稀釋液pH維持在7.0左右。

取加米霉素注射液，用細菌內(nèi)毒素檢查用水進行稀釋，在稀釋過程中加入Tris緩沖液，并最終稀釋至249、498、996、1，992和3，984倍，依法檢測，結見表2。預試驗結果顯示供試品稀釋到498倍及以上稀釋倍數(shù)時，供試品溶液對鱟試劑反應無干擾，根據(jù)上述結果初步選定供試品有效稀釋倍數(shù)為498倍。

2.5 正式干擾試驗

現(xiàn)依法進行正式干擾試驗。取3批加米霉素注射液，用細菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品進行498倍的稀釋（NPC），依法檢測，結果見表2。結果顯示3批依法添加內(nèi)毒素的供試品溶液的反應結果均在0.5～2.0λ之間，依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2015版附錄1143細菌內(nèi)毒素檢查法的要求，認為供試品在該濃度下無干擾作用。

樣品細菌內(nèi)毒素檢查。取加米霉素注射液3批，用內(nèi)毒素檢查用水將樣品稀釋成498倍的供試品溶液（NPC），在稀釋的過程中加入Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH，依法檢測，結果見表4。結果表明3個批次的498倍稀釋的供試品溶液的內(nèi)毒素含量均小于0.25EU/mL，說明3批加米霉素注射液樣品的內(nèi)毒素含量低于0.83EU/mg，符合要求。

3 討論

在預干擾試驗期間，發(fā)現(xiàn)陽性供試品溶液（PPC）經(jīng)常出現(xiàn)無規(guī)律的陰性結果，而陽性對照和陰性對照結果均正常，說明試驗材料、操作及環(huán)境均正常。經(jīng)過一系列因素排查，推測是供試品溶液pH引起的問題。由于處方中含有一定濃度的丁二酸，498倍稀釋液pH為5.6左右，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0之間為宜，因此在樣品稀釋過程中加入Tris緩沖液，使供試品溶液pH維持在7.0左右，再進行預干擾試驗，PPC便沒有再發(fā)生不凝集的現(xiàn)象。

本試驗用兩個廠家的鱟試劑對加米霉素注射液共3個批次的樣品進行了干擾試驗，結果表明：樣品在稀釋的過程中加入pH 7.2的Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH，并最終稀釋至498倍（濃度為0.3mg/mL）的供試品溶液對細菌內(nèi)毒素和鱟試劑反應無干擾，確定所采用的方法可行。加米霉素注射液可適用細菌內(nèi)毒素檢查法，用靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑按凝膠限度檢查法對3批產(chǎn)品進行細菌內(nèi)毒素檢查，結果均符合規(guī)定。

4 結論

本研究建立了加米霉素注射液的細菌內(nèi)毒素檢查法，試驗結果表明加米霉素注射液可適用細菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）;由于加米霉素注射液具有一定的酸性，在做細菌內(nèi)毒素檢查時，會對鱟試劑產(chǎn)生一定的干擾作用，可以通過加入內(nèi)毒素檢查專用Tris緩沖液解決這一問題。

本研究建立的細菌內(nèi)毒素檢查法適用于天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司生產(chǎn)的加米霉素注射液，由于不同廠家的處方工藝不盡相同，內(nèi)毒素檢查干擾因素也不相同，因此對于不同廠家生產(chǎn)的加米霉素注射液應根據(jù)實際情況建立與其適應的內(nèi)毒素檢查方法，以便于更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。

參考文獻：

[1] Menninger JR. Functional consequences of binding macrolidesto ribosomes[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy， 1985， 16（Suppl. A）：23-34.

[2] Zactran： EPAR-Scientific Discussion [EB/OL]. http：//www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Scientific_Discussion/veterinary/000129/WC500068716.pdf.

[3] 陳新宇，曹春然，孫圓媛.枸櫞酸細菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）方法學研究[J].中國藥品標準，2021，22（1）：61.

[4] 朗青.無菌原料藥頭孢噻肟鈉細菌內(nèi)毒素的控制[J].煤炭與化工，2014，37（6）：41.

[5] 中華人民共和國獸藥典2015年版.一部[S].2015：200.

[6] 中華人民共和國藥典2015年版.四部[S].2015：154.