王一，張妍妍

摘要：從沈陽某豬場分離得到一種革蘭氏陰性、無莢膜、無芽孢、短小桿菌，純化后經(jīng)16S rRNA測序分析，初步確定分離菌為腸桿菌科變形桿菌屬，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察和生化試驗(yàn)確定為奇異變形桿菌。將分離菌接種于小鼠，小鼠24h內(nèi)死亡，證實(shí)該菌具有一定的致病性。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，表明該菌對慶大霉素、環(huán)丙沙星較為敏感。本項(xiàng)研究結(jié)果為沈陽地區(qū)豬奇異變形桿菌病的診斷和治療提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬;變形桿菌;分離鑒定;藥敏試驗(yàn)

奇異變形桿菌（proteus mirabilis，PM）屬于腸桿菌科變形桿菌屬成員，變形桿菌屬包括普通變形桿菌、奇異變形桿菌、摩氏變形桿菌、雷氏變形桿菌和無恒變形桿菌五個(gè)種，其中奇異變形桿菌致病性較為嚴(yán)重，廣泛分布于泥土、水、糞便、以及人和動物的體表、黏膜及消化道，是一種常見的條件致病菌，其產(chǎn)生的毒素可引起中毒[1]。奇異變形桿菌能引起人和動物的尿道炎及腎盂腎炎，嚴(yán)重的能導(dǎo)致菌血癥、敗血癥[2]。Bisgaard M等在1981年從患有輸卵管炎蛋雞的輸卵管內(nèi)分離出了奇異變形桿菌[3];江益民（1990）從有腹瀉和呼吸道癥狀的病死雞肝臟中分離出了奇異變形桿菌。葉樹株（1991）在福建發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了豬的奇異變形桿菌病，這是國內(nèi)首次對豬奇異變形桿菌的報(bào)道;隨后，徐春厚（1993）于黑龍江發(fā)現(xiàn)了該病，在之后的幾年里沒有豬奇異變形桿菌發(fā)病的報(bào)道，直至2008年變形桿菌的報(bào)道逐漸增多，四川、江蘇、福建、湖北、廣州[4～8]等地區(qū)也有報(bào)道。病豬以體溫升高，精神沉郁，腹瀉為主要臨床癥狀。剖檢可見病豬肺，肺門淋巴結(jié)、氣管、小腸等有明顯的病理變化[5]。

1材料與方法

1.1 材料

1）病料來源 沈陽某豬場2月齡仔豬發(fā)生體溫升高，精神不振，咳嗽、腹瀉、呼吸困難等癥狀，個(gè)別豬死亡，剖檢可見肺充血出血，呈紅色等，無菌采取肝臟3份，作為待檢病料。

2）主要試劑? 革蘭氏染液、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂按常規(guī)方法配置、生化反應(yīng)管購于杭州濱和微生物試劑有限公司、DNA試劑盒杭州博日科技有限公司、2×Taq酶、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那等11種藥敏試片物購自上海金穗生物科技有限公司。

3） 實(shí)驗(yàn)動物? 選擇體重為18g～22g的昆明小白鼠，共20只，雌雄兼有。

1.2 方法

1）細(xì)菌的分離與純化 無菌條件下采取病豬的肝臟，分區(qū)劃線于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h，將疑似菌純化3代后觀察細(xì)菌形態(tài)。

2） 細(xì)菌染色鏡檢 采用革蘭氏染色對純化后分離菌進(jìn)行染色鏡檢，鏡下觀察其形態(tài)基本一致判定為純化菌。

3） 16S rRNA擴(kuò)增與測序 將分離菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)至對數(shù)期，使用DNA提取試劑盒提取總DNA，取5μL作為PCR模板。擴(kuò)增引物參考William GW[9]設(shè)計(jì)的引物：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492r：5'-TACGCYTACCTTGTTACGACTT-3'，預(yù)期產(chǎn)物大小約1500bp。反應(yīng)體系：分離的細(xì)菌DNA模板5μL，2×Taq聚合酶15μL，引物上下游各1μL，ddH2O 8μL，共30μL;反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃1min，退火55℃0.5min，延伸72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120V，電流100mA，35分鐘后凝膠成像系統(tǒng)照相記錄結(jié)果。獲得預(yù)期產(chǎn)物后送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，采用Blast在線比對分析。

4） 培養(yǎng)特性觀察 將純化后的菌接種于麥康凱、伊紅美藍(lán)、鮮血瓊脂培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h觀察細(xì)菌落形態(tài)。

5） 生化鑒定 參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊進(jìn)行生化試驗(yàn)[10]。將純化后的菌接種于13種生化微量反應(yīng)管封口放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，觀察。

6）藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法測定該菌對常用抗生素的敏感性。測量所得抑菌圈直徑，參照CSLI的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)解釋標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行結(jié)果判定，敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)（見表1）。

2 結(jié)果

2.1 病原分離與形態(tài)特征

在普通培養(yǎng)基上形成無色，半透明的扁平菌落，鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)為革蘭氏陰性小桿菌，呈現(xiàn)多形性，但桿狀居多（見圖1）。

2.2 16S rRNA擴(kuò)增與測序分析

分離菌純培養(yǎng)物利用16S rRNA通用引物27F、1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1500bp左右的特異性目的基因片段，與預(yù)期片段大小基本一致（如圖2）。測序后獲得有效序列1378bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫中采用Blast在線比對分析，SFI分離菌的16s rRNA基因序列與變形桿菌序列的同源性很高，相似性在100%以上的有21株，且均為變形桿菌屬成員，由此可見分離菌為腸桿菌科變形桿菌屬成員。

2.3培養(yǎng)特性

在麥康凱培養(yǎng)基上形成圓形（37℃），扁平，圓形，半透明菌落。（見圖3）;在血瓊脂上呈灰白色平鋪并且有溶血現(xiàn)象;在伊紅美蘭瓊脂上不生長。在麥康凱上25℃培養(yǎng)時(shí)有明顯的遷徙性，呈波浪狀（圖4）。

2.4 生化鑒定結(jié)果

分離株蔗糖、木糖、枸櫞酸鹽、反應(yīng)呈陽性;阿拉伯醇、赤蘚醇、肌醇、麥芽糖、甘露醇、鳥氨酸脫羧酶、衛(wèi)矛醇、乳糖反應(yīng)呈陰性;發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;能產(chǎn)生H2S。參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊，符合奇異變形桿菌的生化特性（見表2）。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果顯示該株奇異變形桿菌對慶大霉素、環(huán)丙沙星敏感，對頭孢喹肟為中敏，對鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、四環(huán)素、妥布霉素、亞胺培南、氯霉素、萬古霉素耐藥（表3）。

2.6 致病性實(shí)驗(yàn)

接種變形桿菌菌懸液后24h內(nèi)，小鼠全部死亡。剖檢可見小鼠腹膜黃染，盲腸脹氣并伴有惡臭，肝臟腫脹脆弱易碎（圖5）。小鼠的心血接種均能分離到變形桿菌。對照組小鼠表現(xiàn)正常，無死亡。證明該菌對小鼠有致病性。

3討論

奇異變形桿菌在目前我國公布的細(xì)菌性食物中毒病原譜中排名第四，是引起食物中毒主要病原之一[12]。近些年關(guān)于豬變形桿菌病發(fā)病的報(bào)道越來越多，本實(shí)驗(yàn)將臨床出現(xiàn)體溫升高，精神沉郁，腹瀉的病豬剖檢，獲得一株細(xì)菌，該菌在臨床癥狀，發(fā)病日齡，剖檢變化與沙門氏菌發(fā)病十分相似，后經(jīng)16s rRNA送檢測序和生化實(shí)驗(yàn)確定為豬的奇異變形桿菌，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了致病性試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)，為臨床治療提供理論依據(jù)。

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