薛文斌 盧正君 董長青

目的：研究甘草酸二鉀和姜黃素復(fù)配乳液的舒緩功效。

方法：MTT法檢測復(fù)配乳液對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性;選擇無毒性濃度構(gòu)建LPS刺激模型，酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α的含量。初步人體實驗隨機選取6名敏感皮膚志愿者，臉部使用復(fù)配乳液4周，4周后檢測水分含量、經(jīng)皮水分流失的變化并拍照觀察。

結(jié)果：復(fù)配乳液a及b在0.556毫克/毫升濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞無毒性;RAW264.7細(xì)胞在給予LPS 刺激后，TNF-α含量顯著升高（P<0.01）;復(fù)配乳液a 在0.55毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升濃度下能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)下TNF-α 的生成（P<0.01和P<0.05）;復(fù)配乳液b 在0.185 毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升濃度下能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)下TNF-α的生成（P<0.05和P<0.01）。初步人體實驗顯示，使用復(fù)配乳液a、b4周后，臉部水分含量顯著增加（P<0.01），經(jīng)皮水分流失顯著減少（P<0.01）。

結(jié)論：甘草酸二鉀和姜黃素復(fù)配乳液a及b可抑制TNF-α的生成，具有一定舒緩功效。

舒緩，一般是指能夠緩解皮膚泛紅、發(fā)熱、刺痛等現(xiàn)象的能力。這些問題通常由外界刺激引起，一般都會伴有炎癥的產(chǎn)生。近年來，開發(fā)具有舒緩功效的化妝品成為各化妝品公司的研究熱點，化妝品原料中純天然植物提取物又以其安全無毒、溫和無刺激及較強的舒緩能力而備受青睞。甘草是一種傳統(tǒng)的舒緩草本植物，甘草具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性。甘草次酸和甘草酸是從甘草中分離得到的特殊化合物。甘草酸二鉀是甘草酸二鉀鹽，是一種應(yīng)用廣泛的抗炎劑。Lee等發(fā)現(xiàn)甘草酸二鉀具有改善特應(yīng)性皮炎的作用。姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種多酚類化合物，具有良好的抗炎特性，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子含量及其基因表達(dá)。脂多糖（lipopolysaccharide） 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是臨床革蘭陰性細(xì)菌引發(fā)敗血癥的主要原因。脂多糖活化的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，被廣泛用于研究炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞在脂多糖的刺激下，可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1等多種炎癥因子迅速合成與釋放。本研究將甘草酸二鉀和姜黃素進(jìn)行復(fù)配，配合水、油脂、乳化劑、流變調(diào)節(jié)劑等制備成兩種化妝品乳液，通過構(gòu)建LPS 誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型及初步人體實驗來評價兩種復(fù)配乳液的舒緩功效。

Part 1實驗材料

1.1 細(xì)胞株與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自廣東博溪生物科技有限公司;DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購自Gibco;臺盼藍(lán)購自Thermo;LPS購自Sigma;MTT 購自Biosharp;二甲基亞砜（DMSO）購自Admas-Beta;小鼠TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;甘草酸二鉀購自甘肅泛植制藥有限公司;姜黃素購自韓國NFC;乳化劑甘油硬脂酸酯檸購自Symrise;EMT-10 購自SEPPIC S.A;PEG-10 聚二甲基硅氧烷購自Shin-Etsu Silicones （Thailand） Limited;二硬脂二甲銨鋰蒙脫石購自海名斯英國有限公司。

1.2 受試樣品

甘草酸二鉀、姜黃素復(fù)配乳液由本公司內(nèi)部復(fù)配，輔以水、油脂、乳化劑、流變調(diào)節(jié)劑等復(fù)配成乳液a及乳液b兩種乳液。配方詳見表1。

1.3 儀器設(shè)備

CO培養(yǎng)箱（上海博迅，BC-J160）;生物安全柜（上海尚道，BHC-1300IIA2）; 酶標(biāo)儀（TECAN，InfiniteF50）;離心機（湖南湘儀，H1850R）;細(xì)胞計數(shù)儀（Thermo，Countess Ⅲ）; 倒置顯微鏡（奧林巴斯，CKX53）;水浴鍋（ 江陰市保利科研器械有限公司，BHS-4）;Cutometer? dual MPA 580（德國Courage+khazaka）;便攜式經(jīng)皮水分流失儀（Delfin）;Antera 3D（Delfin）。

Part 2?實驗方法

2.1 樣品處理

細(xì)胞實驗：復(fù)配乳液a 和復(fù)配乳液b 分別稱取0.5克，用蒸餾水定容到總體積為5 毫升，制成濃度為100 毫克/毫升的水溶液。給藥時將此水溶液200微升加入到3.8毫升高糖DMEM（含10% 胎牛血清）中，20微米過濾膜過濾除菌，制成含復(fù)配乳液濃度為5毫克/毫升的培養(yǎng)基溶液，再以3倍稀釋，分別制成含復(fù)配乳液濃度為1.667毫克/ 毫升、0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升、0.021毫克/毫升的培養(yǎng)基溶液。以上樣品現(xiàn)配現(xiàn)用。初步人體實驗直接將復(fù)配乳液涂抹于臉部。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 以每瓶8.0×106個細(xì)胞接種于T75培養(yǎng)瓶中、高糖DMEM（含10% 胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗）、37攝氏度，5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)，

每天換液。待細(xì)胞融合率為80% ～ 90% 時進(jìn)行傳代，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，離心吹打混勻傳代培養(yǎng)，以每瓶8.0×106 個細(xì)胞接種于T75 培養(yǎng)瓶中，2 天傳一次代。

2.3 實驗分組

細(xì)胞毒性檢測設(shè)置空白對照、陰性對照、樣品及陽性對照;LPS 刺激模型檢測設(shè)置空白對照、陰性對照（NC）、樣品及陽性對照（PC）。

2.4 細(xì)胞毒性檢測

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，離心吹打混勻，計數(shù)，按每100微升/ 孔含3.0×104個細(xì)胞鋪于96 孔板中，37 攝氏度，5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。24小時后小心吸棄每孔培養(yǎng)基，加入不同濃度的待測物，每個濃度3 個復(fù)孔，繼續(xù)放入37 攝氏度，5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)20小時。20小時后每孔加入5毫克/ 毫升的MTT 溶液，繼續(xù)放入37℃，5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時。4小時后小心吸棄每孔上清，加入150微升/ 孔的DMSO吹打至充分混勻，室溫避光放置30 分鐘。用槍將細(xì)胞懸液再次吸打混勻，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD492 納米處測量各孔的吸光值（OD值）。

2.5 細(xì)胞毒性計算 ）

細(xì)胞相對活率（%）=（樣本OD-空白OD）/（ 陰性對照OD-空白OD）×100%

2.6 脂多糖（LPS）刺激RAW264.7炎癥模型檢測

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，離心吹打混勻，計數(shù)，按每100微升/孔含3.0×104個細(xì)胞鋪于96孔板中，37攝氏度，5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。24小時后小心吸棄培養(yǎng)基，按照MTT 毒性結(jié)果，加入含復(fù)配乳液安全濃度的培養(yǎng)基溶液，37攝氏度，5% CO培養(yǎng)箱預(yù)處理2小時?？瞻讓φ?、陰性對照加入正常培養(yǎng)基;陽性對照加入100微克/ 毫升的地塞米松，同樣37 攝氏度，5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)處理2小時。2小時預(yù)處理結(jié)束后，除空白對照孔外，每孔加入終濃度為10微克/毫升的LPS進(jìn)行刺激，37攝氏度，5% CO培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 小時。24小時孵育培養(yǎng)結(jié)束后，每孔收集200微升細(xì)胞培養(yǎng)上清液于1.5毫升無菌離心管中，置于-80攝氏度超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。按照ELISA 檢測試劑盒說明進(jìn)行TNF-α含量檢測。

2.7初步人體實驗

隨機選取6 名敏感皮膚志愿者，臉部使用復(fù)配乳液四周，檢測6 名志愿者使用前及使用4 周后臉部水分含量、經(jīng)皮水分流失的變化，并進(jìn)行拍照觀察。

2.8統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用t 檢驗分析方法，以P<0.05為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

Part 3實驗結(jié)果

3.1 復(fù)配乳液對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 毒性檢測MTT 結(jié)果顯示，以相對活率90% 以上為無毒性標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)配乳液a 和復(fù)配乳液b 在0.556 毫克/ 毫升濃度及此濃度以下對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 均無毒性，可選取為LPS 刺激炎癥模型的實驗濃度，具體見表2，細(xì)胞相對活率如圖1所示。

3.2 復(fù)配乳液對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生TNF-α的影響

根據(jù)毒性測試結(jié)果，選擇復(fù)配乳液a（0.556毫克/毫升、0.185毫克/毫升、0.062毫克/ 毫升）及b（0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升）3個無毒性濃度分別進(jìn)行實驗，結(jié)果顯示小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在LPS 的誘導(dǎo)下TNF-α含量顯著上升（P<0.01）;復(fù)配乳液a（0.556毫克/毫升、0.185毫克/ 毫升）能顯著抑制LPS誘導(dǎo)下TNF-α的生成（P<0.01 和P<0.05）;復(fù)配乳液b（0.185毫克/ 毫升、0.062毫克/毫升）能顯著抑制LPS誘導(dǎo)下TNF-α的生成（P<0.05 和P<0.01）;同濃度復(fù)配乳液a 和b相比，0.556毫克/ 毫升、0.185毫克/毫升無顯著差異，0.062毫克/ 毫升具有極顯著差異（P<0.01）。具體見表3，TNF-α含量趨勢如圖2所示。

3.3 初步人體實驗結(jié)果

結(jié)果顯示在使用復(fù)配乳液a、b4周后，與不使用產(chǎn)品的臉部對比水分含量顯著增加（P<0.01）;經(jīng)皮水分流失顯著下降（P<0.01）;臉部拍照顯示血紅素含量顯著下降。具體見表4，如圖3 所示，臉部拍照結(jié)果如圖4所示。

Part 4結(jié)論

近年來，化妝品舒緩功效的研究越來越得到人們的重視，舒緩原料是舒緩功效的核心，而原料不能直接作用于人體，將原料進(jìn)行復(fù)配，制成化妝水、乳或霜是通用的方法，但當(dāng)多種原料及輔料共同混合后，原料含量降低，且原料之間可能存在互相影響，舒緩原料是否能發(fā)揮其原來的舒緩功效需要進(jìn)行驗證。

本研究通過構(gòu)建LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型結(jié)合初步人體實驗來評價甘草酸二鉀、姜黃素復(fù)配乳液a、b的舒緩功效。實驗結(jié)果顯示，復(fù)配乳液a、b均能夠顯著抑制炎癥因子TNF-α的生成。初步人體實驗結(jié)果亦顯示其作用于人體皮膚具有一定的舒緩功效。

作者介紹：

薛文斌、盧正君、董長青：上海宜儂生物科技有限公司研發(fā)中心