張 涵 鄭 亮,2 黃 卓 宋衛(wèi)堂,2*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 水利與土木工程學(xué)院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部設(shè)施農(nóng)業(yè)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

日光溫室是我國(guó)北方特有的農(nóng)業(yè)設(shè)施形式，因其造價(jià)較低且節(jié)約能源而得到了大面積的推廣應(yīng)用[1]。由于日光溫室相對(duì)封閉，常面臨溫濕度高、通風(fēng)性較差等問(wèn)題[2]，使得病原微生物極易生存和繁殖，且土傳病害病原菌的抗逆性高，存活力強(qiáng)[3]。溫室內(nèi)作物連作生產(chǎn)，土壤中的植株殘?bào)w及根系分泌物為病原物提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)和寄生載體，導(dǎo)致土壤環(huán)境惡化，土傳病害嚴(yán)重[4]，對(duì)溫室土壤進(jìn)行消毒具有重要意義。

傳統(tǒng)土壤消毒方式有物理消毒(如太陽(yáng)能消毒、蒸汽消毒等)和化學(xué)消毒及生物防治等[5-6]。但太陽(yáng)能消毒不適宜太陽(yáng)輻射少的地區(qū)，且效果局限于土壤表層[7]。蒸汽消毒要求土溫必須在70 ℃以上保持30 min，對(duì)消毒溫度及時(shí)間要求嚴(yán)格，消毒設(shè)備成本較高，裝配難度大[8]。利用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行土壤消毒是目前農(nóng)戶(hù)的首要選擇，但長(zhǎng)期使用農(nóng)藥會(huì)引起病原物產(chǎn)生抗藥性和耐藥性[9]，而且農(nóng)藥超標(biāo)使用導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留問(wèn)題，將影響設(shè)施產(chǎn)品的商品性[10]。生物熏蒸方式利用植物在有機(jī)質(zhì)分解過(guò)程中釋放出揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)抑制或殺死土壤中的有害生物[11]，生物熏蒸劑作用的基本原理以及土壤和植物之間的關(guān)系仍有待研究[6]。在有機(jī)農(nóng)業(yè)新形勢(shì)下，作物病害管理應(yīng)做到“防控為主，治療為輔”，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)園藝產(chǎn)品安全、高品質(zhì)生產(chǎn)。

臭氧水是臭氧部分溶于水后形成的具有廣譜、高效殺菌作用的強(qiáng)氧化劑，常溫下可還原為氧氣，對(duì)環(huán)境不會(huì)產(chǎn)生污染，無(wú)殘留毒性。臭氧水殺菌具有破壞微生物遺傳物質(zhì)、細(xì)胞膜、及生存所需酶和蛋白質(zhì)等多種途徑，相比殺菌原理單一的農(nóng)藥，可有效減少抗藥性的產(chǎn)生[12-14]。此外，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)綠色有機(jī)概念的認(rèn)識(shí)逐漸增強(qiáng)。臭氧不但能夠降解土壤中的有機(jī)農(nóng)藥，還可以降低重金屬離子的流動(dòng)性從而減少重金屬離子通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)的積累。將臭氧水用于溫室內(nèi)的土壤澆灌，預(yù)期可以達(dá)到殺菌消毒，防控病害的效果[15-16]，具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，關(guān)于利用臭氧水防治土傳病害的研究多集中于病原菌的離體試驗(yàn)，已證實(shí)其對(duì)多種植物致病病原菌的殺滅或抑制作用。在盆栽條件下，澆灌臭氧水均可改善西瓜嫁接苗連作土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，降低根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)病率，在一定程度上緩解西瓜的連作障礙，其中ρ(O3)=1.5 mg/L的臭氧水效果最為顯著[17]。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液中ρ(O3)=4.0 mg/L時(shí)，對(duì)基質(zhì)中線(xiàn)蟲(chóng)的滅殺率可達(dá)到88.3%[18]。用不同濃度的臭氧水處理灰霉菌(Botrytiscinerea)、葉霉病菌(Fulviafulva)以及瓜鏈格孢菌(Alternariacucumerina)，結(jié)果顯示臭氧水處理組菌落及菌絲生長(zhǎng)均得到抑制，其中ρ(O3)=2.5 mg/L的臭氧水對(duì)菌絲的生長(zhǎng)抑制作用最佳[19]。臭氧殺滅營(yíng)養(yǎng)液中3種植物病原菌所需的殘余臭氧濃度與接觸時(shí)間的研究結(jié)果表明，ρ(O3)=0.6 mg/L，接觸時(shí)間5 min時(shí)，臭氧對(duì)103CFU/mL濃度黃瓜枯萎病、番茄枯萎病和106CFU/mL濃度十字花科軟腐病的殺滅率均接近100%[16]。說(shuō)明臭氧水在一定程度上可以代替化學(xué)農(nóng)藥，用于植物病蟲(chóng)害的防治。

相比傳統(tǒng)農(nóng)藥或物理消毒方式，臭氧水澆灌土壤是一種簡(jiǎn)便易行的替代方式，但尚缺乏系統(tǒng)試驗(yàn)論證。本研究擬針對(duì)臭氧水應(yīng)用于溫室土壤消毒的濃度、灌溉周期以及深層土壤的消毒效果進(jìn)行研究，以期為利用臭氧水防控溫室內(nèi)土傳病害提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年7月—10月，在日光溫室的休耕期進(jìn)行。日光溫室位于北京市昌平區(qū)(40°13′ N，116°16′ E)，溫室坐北朝南，沿東西走向延長(zhǎng)，南北跨度10.3 m，頂高4.4 m，東西長(zhǎng)97 m。土壤微生物的觀(guān)測(cè)和計(jì)數(shù)在現(xiàn)場(chǎng)取樣留存，于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站微生物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

在日光溫室內(nèi)將試驗(yàn)土壤劃分為多個(gè)1 m×1 m的區(qū)域作為獨(dú)立試驗(yàn)區(qū)，每次澆灌臭氧水后，將各試驗(yàn)區(qū)獨(dú)立覆蓋地膜，覆蓋采用白色PE農(nóng)用地膜(0.03 mm)，用以延緩臭氧散失、維持土溫，輔助提升消毒效果。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1臭氧水制備與土壤的理化性質(zhì)

臭氧水制備裝置主要由臭氧發(fā)生器、氧氣瓶、氣液混合泵、溶解臭氧濃度檢測(cè)器和儲(chǔ)液桶組成。以氧氣為氣源，為貼近生產(chǎn)實(shí)際，制備用水選用靜置過(guò)夜的自來(lái)水。氧氣通入臭氧發(fā)生器內(nèi)通過(guò)高壓放電反應(yīng)產(chǎn)生臭氧，臭氧氣體利用氣液混合泵混入儲(chǔ)液桶的自來(lái)水中以制備不同濃度的臭氧水，臭氧水的濃度采用Q45H/64溶解臭氧檢測(cè)儀器(ANALYICAL TECHNOLOGY, INC., 美國(guó))檢測(cè)。臭氧水土壤澆灌在上午8:00進(jìn)行，將儲(chǔ)液桶中加入10 L自來(lái)水，用硝酸調(diào)節(jié)水的pH為4.0，以提高臭氧水的穩(wěn)定性[17]，分別制備所需濃度的臭氧水用于試驗(yàn)區(qū)的土壤澆灌試驗(yàn)。

試驗(yàn)前對(duì)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，原始土壤含水率為35%～40%，pH7.04，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.3和18.8 mg/kg，有機(jī)質(zhì)2.3%。

1.2.2土壤微生物計(jì)數(shù)

土壤中細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌等微生物計(jì)數(shù)采用系列稀釋和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法。用滅菌后的工具取10 g土樣稀釋入90 mL無(wú)菌蒸餾水，然后將土壤溶液進(jìn)行系列稀釋[20-21]，分別涂布于LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基，用于細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌的培養(yǎng)。測(cè)定土壤含水量，計(jì)算每g干土中的細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌數(shù)量，CFU/g。

土壤中線(xiàn)蟲(chóng)分離及計(jì)數(shù)：取0～30 cm深度的土壤樣品100 g，采用食鹽懸浮離心法分離線(xiàn)蟲(chóng)，在體視顯微鏡(SZ51，奧林巴斯，日本)下觀(guān)察計(jì)數(shù)，并測(cè)定土壤含水率，計(jì)算每100 g干土中含有的線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)目。

微生物減退率=[(N0-N)/N0]×100%

式中：N0為原始土壤中的微生物數(shù)；N為處理后土樣中的微生物數(shù)。

1.2.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為系統(tǒng)研究酸性臭氧水在溫室土壤消毒中的應(yīng)用方法，本研究從臭氧水消毒的土壤覆蓋范圍、適宜濃度和合理澆灌周期等問(wèn)題出發(fā)，分別設(shè)計(jì)了系列現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。

1)臭氧水消毒的土壤深度覆蓋范圍試驗(yàn)。設(shè)置5個(gè)1 m×1 m的試驗(yàn)區(qū)，以自來(lái)水為對(duì)照組(ρ(O3)=0 mg/L)，分別用ρ(O3)=5、10、15、20 mg/L的臭氧水間隔3 d澆灌1次，每次澆灌10 L，連續(xù)澆灌3次。3次處理結(jié)束后48 h，取表層0～5 cm的土壤和深層15～20 cm(黃瓜、番茄的主根可達(dá)到20 cm 深的土層)的土壤，檢測(cè)樣品中微生物的數(shù)量。

2)溫室土壤消毒的適宜臭氧水濃度試驗(yàn)。高濃度的臭氧水制備難度較高且半衰期較短，因而生產(chǎn)中以低濃度的臭氧水為宜，為驗(yàn)證低濃度臭氧水重復(fù)處理能否替代高濃度臭氧水達(dá)到適宜的消毒效果，設(shè)置了ρ(O3)=5 mg/L和ρ(O3)=20 mg/L 2個(gè)處理組。ρ(O3)=20 mg/L處理于第1 天澆灌臭氧水1次，澆灌10 L，ρ(O3)=5 mg/L處理分別于第1、4、7 天各澆灌1次，澆灌10 L，澆灌完成均立刻覆膜。第9天，取2個(gè)試驗(yàn)組0～30 cm的土壤檢測(cè)微生物數(shù)量。

3)溫室土壤消毒的適宜臭氧水澆灌制度的試驗(yàn)。為防止土壤消毒對(duì)作物生長(zhǎng)的影響，溫室土壤消毒一般在休耕期(夏季，1～2個(gè)月)進(jìn)行。本試驗(yàn)?zāi)M了在休耕期進(jìn)行土壤消毒，并檢驗(yàn)休耕期結(jié)束后第30天和第60天土壤中微生物的消減率，以對(duì)比臭氧水處理組與石灰氮對(duì)照組的實(shí)際使用效果。本試驗(yàn)設(shè)置了不同的臭氧水質(zhì)量濃度及澆灌時(shí)間間隔(3、7、10 d)，用以驗(yàn)證合理處理制度及其對(duì)土壤消毒后的中長(zhǎng)期效果。

本試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)組：Ⅰ組為對(duì)照組，試驗(yàn)第1天施入0.1 kg石灰氮后澆水10 L并覆膜；其余為處理組，各組分別取5個(gè)1 m×1 m的試驗(yàn)區(qū)，澆灌自來(lái)水(ρ(O3)=0 mg/L)及ρ(O3)=5、10、15、20 mg/L 的臭氧水。澆灌周期如下：

Ⅱ組，試驗(yàn)開(kāi)始第1、4、7 天間隔3 d澆灌1次，連續(xù)澆灌3次。

Ⅲ組，試驗(yàn)開(kāi)始第1、8、15天 間隔7 d澆灌1次，連續(xù)澆灌3次。

Ⅳ組，試驗(yàn)開(kāi)始第1、11、21天間隔10 d澆灌1次，連續(xù)澆灌3次。

第30天和第60天?、瘛ⅱ?、III、Ⅳ組內(nèi)各區(qū)的土壤樣品檢測(cè)微生物數(shù)量，各區(qū)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

4)臭氧水消毒對(duì)溫室土壤微生物群落影響試驗(yàn)。為驗(yàn)證臭氧水是否會(huì)降低土壤微生物多樣性、改變菌群比例，進(jìn)一步驗(yàn)證臭氧水防控土傳病害的可行性設(shè)計(jì)此試驗(yàn)。設(shè)置2個(gè)1 m×1 m的試驗(yàn)區(qū)，分別為石灰氮對(duì)照組和臭氧水處理組。對(duì)照組在試驗(yàn)開(kāi)始第1 天施入0.1 kg石灰氮后澆10 L自來(lái)水并覆膜。處理組在試驗(yàn)開(kāi)始第1、8、15天澆灌10 Lρ(O3)=10 mg/L的臭氧水，于第30天采用五點(diǎn)取樣法取樣。通過(guò)對(duì)比分析其Alpha多樣性指數(shù)(Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Coverage指數(shù)和ACE指數(shù))，比較各處理對(duì)土壤微生物群落多樣性和豐富度的影響。選擇測(cè)序結(jié)果中含量在1%以上的益生菌進(jìn)行分析和比較各組硝酸菌屬、亞硝酸菌屬、芽孢菌屬和鏈霉菌屬的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，利用Tukey法進(jìn)行不同處理樣本間差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧水對(duì)不同深度土壤微生物的消減效果

土壤表層致病微生物可接觸作物的根、莖和葉位較低的葉片，引發(fā)作物病害，而土壤深層致病微生物亦可侵染植物根系使其染病。本試驗(yàn)分別取臭氧水處理后的0～5 cm表層土壤和15～20 cm深層土壤進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示臭氧水對(duì)表層土壤的細(xì)菌類(lèi)微生物消減效果在數(shù)值上略高于深層土壤，但不同質(zhì)量濃度臭氧水對(duì)表層和深層土壤中細(xì)菌和真菌類(lèi)微生物的消減效果差異均不顯著；放線(xiàn)菌的試驗(yàn)結(jié)果與之類(lèi)似，除ρ(O3)=20 mg/L處理組外，其他處理組表層放線(xiàn)菌消減率和深層土壤放線(xiàn)菌消減率不存在顯著差異(圖1)。可知，在本試驗(yàn)條件下，臭氧水的土壤微生物消減效果至少可以到達(dá)黃瓜、番茄等常見(jiàn)溫室作物根系分布的15～20 cm土層。

不同小寫(xiě)字母表示處理間存在顯著差異，n.s表示無(wú)顯著差異，圖2同。The different lowercase letters stand for significant difference between treatments. n.s stands forno significant difference, Fig.2 is the same.圖1 不同質(zhì)量濃度臭氧水對(duì)表層(0～5 cm)和深層(15～20 cm)土壤中細(xì)菌(a)、真菌(b)、放線(xiàn)菌(c)的消減效果Fig.1 Subtractive effects of ozone water with different mass concentrations on bacteria (a), fungi (b) and Actinomycetes (c) in topsoil (0-5 cm) and deep soil (15-20 cm)

2.2 臭氧水濃度對(duì)土壤微生物的消減效果

高質(zhì)量濃度臭氧水1次澆灌和低質(zhì)量濃度臭氧水3次澆灌對(duì)土壤微生物消減效果見(jiàn)圖2。用ρ(O3)=20 mg/L的臭氧水澆灌1次，土壤中細(xì)菌、真菌和線(xiàn)蟲(chóng)的消減率分別為20.5%、39.4%、27.0%，用ρ(O3)=5 mg/L的臭氧水間隔3 d澆灌1次，連續(xù)澆灌3次，土壤中細(xì)菌、真菌和線(xiàn)蟲(chóng)的消減率分別為49.1%、51.5%和59.5%，效果明顯優(yōu)于高濃度處理組。ρ(O3)=20 mg/L的臭氧水澆灌1次后，土壤中放線(xiàn)菌數(shù)量與原始放線(xiàn)菌數(shù)量差異不顯著，而用ρ(O3)=5 mg/L臭氧水澆灌3次，土壤放線(xiàn)菌消減率為52.5%，顯著高于高濃度處理組。由此可知，在本試驗(yàn)條件下，使用ρ(O3)=5 mg/L的臭氧水重復(fù)澆灌3次，可以達(dá)到優(yōu)于單次使用ρ(O3)=20 mg/L臭氧水對(duì)土壤中微生物的殺滅效果。

圖2 低濃度3次澆灌和高濃度1次澆灌土壤中微生物數(shù)量Fig.2 The number of microorganisms in the soil with 3 treatments at low concentration and 1 treatment at high concentration

2.3 臭氧水適宜澆灌濃度和澆灌間隔

不同質(zhì)量濃度臭氧水澆灌間隔對(duì)土壤中細(xì)菌的消減效果見(jiàn)表1。

澆灌臭氧水第30天，對(duì)照組細(xì)菌減退率為22.92%。Ⅱ組ρ(O3)=20 mg/L區(qū)的減退率最高，ρ(O3)=15 mg/L區(qū)有所降低但與ρ(O3)=20 mg/L區(qū)的差異不顯著，ρ(O3)=5、10 mg/L的2個(gè)區(qū)的減退率降低。Ⅲ組ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)差異不顯著。Ⅳ組ρ(O3)=10、15、20 mg/L的3個(gè)區(qū)的細(xì)菌減退率差異不顯著。

澆灌臭氧水第60天，對(duì)照組細(xì)菌減退率為22.61%。Ⅱ組內(nèi)ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)減退率最高，Ⅲ組內(nèi)ρ(O3)=5、10 mg/L的2個(gè)區(qū)細(xì)菌減退率較低，ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)的細(xì)菌減退率顯著提升，Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=5、10 mg/L的2個(gè)區(qū)較低，ρ(O3)=15 mg/L區(qū)的細(xì)菌減退率有所提升，ρ(O3)=20 mg/L區(qū)的細(xì)菌減退率最高。3次澆灌完成后，從同一濃度、不同澆灌間隔的結(jié)果顯示，用ρ(O3)=5 mg/L的臭氧水間隔3、7 d澆灌的細(xì)菌消減率為49.10%，高于間隔10 d的處理組。用ρ(O3)=10、15、20 mg/L的臭氧水連續(xù)澆灌土壤，間隔3、7、10 d的細(xì)菌消減率逐漸降低。

可見(jiàn)，ρ(O3)=10～15 mg/L的臭氧水可達(dá)到較好的殺滅土壤中細(xì)菌的效果，隨臭氧水濃度增大，細(xì)菌減退率提升不明顯。第60天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)的ρ(O3)=10 mg/L區(qū)細(xì)菌消減率分別為36.60%、44.64% 和43.75%，Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)的ρ(O3)=15 mg/L區(qū)細(xì)菌消減率分別為50.89%、56.25%和49.10%，差異均不顯著。由此可知，在本試驗(yàn)條件下，間隔7～10 d澆灌1次ρ(O3)=10～15 mg/L的臭氧水可取得較好的殺滅細(xì)菌效果。

不同質(zhì)量濃度臭氧水澆灌間隔對(duì)土壤中真菌的消減效果見(jiàn)表2。

澆灌臭氧水第30天，對(duì)照組真菌消減率為63.63%，除Ⅲ組內(nèi)ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)外，處理組其余區(qū)均低于對(duì)照組。除ρ(O3)=0 mg/L區(qū)外，Ⅱ組內(nèi)各區(qū)真菌消減率差異不顯著。Ⅲ組內(nèi)ρ(O3)=5、10 mg/L的2個(gè)區(qū)滅菌率差異不顯著，ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)差異不顯著。Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=10、15、20 mg/L的3個(gè)區(qū)滅菌率不存在顯著差異。

表1 不同質(zhì)量濃度臭氧水澆灌時(shí)間間隔對(duì)土壤中細(xì)菌的消減效果Table 1 Removal effect of soil bacteria by different concentration of ozone water irrigation intervals

澆灌臭氧水第60天，對(duì)照組真菌消減率為52.52%，Ⅱ組內(nèi)各區(qū)消減率均低于對(duì)照組，Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)的ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)高于對(duì)照組。除ρ(O3)=0 mg/L區(qū)外，Ⅱ、Ⅲ組內(nèi)各區(qū)差異不顯著，Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=10、15、20 mg/L的3個(gè)區(qū)差異不顯著。

結(jié)果表明，ρ(O3)=10～15 mg/L是臭氧水殺滅土壤真菌的適宜質(zhì)量濃度，臭氧水濃度增加對(duì)消減率的提升不明顯。第60天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)的ρ(O3)=10 mg/L區(qū)真菌消減率分別為42.42%、51.51% 和53.53%，Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)的ρ(O3)=15 mg/L區(qū)真菌消減率分別為47.47%、54.54%和55.55%，Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著。由此可知，間隔7～10 d澆灌1次ρ(O3)=10～15 mg/L 的臭氧水可取得較好的土壤真菌消減效果。

不同質(zhì)量濃度臭氧水澆灌間隔對(duì)土壤中放線(xiàn)菌的消減效果見(jiàn)表3。

澆灌臭氧水第30天，對(duì)照組放線(xiàn)菌消減率為50.34%，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)的放線(xiàn)菌消減率均高于對(duì)照組。Ⅱ組內(nèi)ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)消減率差異不顯著，Ⅲ區(qū)內(nèi)ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)消減率差異不顯著，Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=10、15 mg/L的2個(gè)區(qū)的消減率差異不顯著，消減率顯著低于ρ(O3)=20 mg/L區(qū)。

澆灌臭氧水第60天，對(duì)照組放線(xiàn)菌消減率為43.30%，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)的放線(xiàn)菌消減率均高于對(duì)照組。Ⅱ組內(nèi)ρ(O3)=10、15、20 mg/L的3個(gè)區(qū)放線(xiàn)菌消減率差異不顯著，Ⅲ組內(nèi)ρ(O3)=15、20 mg/L的2個(gè)區(qū)消減率差異不顯著，Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=5、10、15 mg/L的3個(gè)區(qū)放線(xiàn)菌消減率差異不顯著，消減率顯著低于ρ(O3)=20 mg/L區(qū)。

表2 不同質(zhì)量濃度臭氧水澆灌時(shí)間間隔對(duì)土壤中真菌的消減效果Table 2 Removal effect of soil fungi by different concentration of ozone water irrigation intervals

表3 不同質(zhì)量濃度臭氧水澆灌時(shí)間間隔對(duì)土壤中放線(xiàn)菌的消減效果Table 3 Removal effect of soil actinomycetes by different concentration of ozone water irrigation intervals

綜上表明，ρ(O3)=10～15 mg/L是臭氧水消減土壤放線(xiàn)菌的適宜質(zhì)量濃度，臭氧水濃度升高對(duì)消減率的提升不明顯。第60天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=10 mg/L區(qū)放線(xiàn)菌消減率分別為52.24%、42.65%和46.12%，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=15 mg/L區(qū)放線(xiàn)菌消減率分別為53.06%、51.42%和47.55%，Ⅱ、Ⅲ組差異不顯著。由此可知，間隔3～7 d澆灌1次ρ(O3)=10～15 mg/L 的臭氧水可以取得更好的放線(xiàn)菌消減效果。

不同質(zhì)量濃度臭氧水澆灌間隔對(duì)土壤中線(xiàn)蟲(chóng)的消減效果見(jiàn)表4。

澆灌臭氧水第30天，對(duì)照組的線(xiàn)蟲(chóng)消減率為85.58%，顯著高于處理組殺線(xiàn)蟲(chóng)效果。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組均表現(xiàn)為ρ(O3)=10、15、20 mg/L的3個(gè)區(qū)之間的線(xiàn)蟲(chóng)消減率差異不顯著。

澆灌臭氧水第60天，對(duì)照組的線(xiàn)蟲(chóng)消減率為77.47%，顯著高于處理組殺線(xiàn)蟲(chóng)效果。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組均表現(xiàn)為ρ(O3)=5、10、15、20 mg/L的3個(gè)區(qū)之間的差異不顯著。

結(jié)果表明，ρ(O3)=10 mg/L是臭氧水消減土壤線(xiàn)蟲(chóng)的適宜質(zhì)量濃度，臭氧水濃度升高對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)消減率提升效果不顯著。第60天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組內(nèi)ρ(O3)=10 mg/L區(qū)線(xiàn)蟲(chóng)消減率分別為56.75%、44.14%， 48.64%，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著。因此，在此試驗(yàn)條件下，用ρ(O3)=10 mg/L的臭氧水間隔7～10 d澆灌1次殺線(xiàn)蟲(chóng)效果更好，但由于處理組線(xiàn)蟲(chóng)消減率低于對(duì)照組，對(duì)于臭氧水能否對(duì)有效控制線(xiàn)蟲(chóng)相關(guān)的病害仍需進(jìn)一步研究。

表4 不同質(zhì)量濃度臭氧水澆灌時(shí)間間隔對(duì)土壤中線(xiàn)蟲(chóng)的消減效果Table 4 Removal effect of soil nematodes by different concentration of ozone water irrigation intervals

2.4 臭氧水消毒對(duì)溫室土壤微生物群落的影響

多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示樣本Coverage指數(shù)均在99%以上(表5)，表明測(cè)序結(jié)果能夠很好的代表樣本真實(shí)情況。表中數(shù)據(jù)為Species物種分類(lèi)水平上的觀(guān)測(cè)數(shù)據(jù)，可知，原始土壤、對(duì)照組土壤、處理組土壤測(cè)到細(xì)菌物種分別為812、814、815個(gè)。Sobs指數(shù)反應(yīng)豐富度的實(shí)際觀(guān)測(cè)值，Shannon指數(shù)反映群落多樣性，ACE指數(shù)用于估計(jì)樣本的群落豐富度，可見(jiàn)原始土壤、對(duì)照組土壤和處理組土壤的群落多樣性和群落豐富度差異不大。

表5 Alpha多樣性指數(shù)Table 5 Alpha diversity index

土壤微生物中含有許多對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有益的菌，在原始土壤、對(duì)照組土壤和處理組土壤樣品的試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，原始土壤、對(duì)照組土壤和處理組土壤細(xì)菌中分別含有硝酸細(xì)菌屬1.2%、1.6%、2.1%；亞硝酸細(xì)菌屬1.2%、1.7%、1.6%；芽孢桿菌屬1.1%、2.2%、2.1%；鏈霉菌屬1.7%、2.2%、1.6%。原始土壤、對(duì)照組土壤和處理組土壤中含量在1%以上的益生菌總量的占比分別為5.2%、7.7%和7.4%。

圖3 原始組、對(duì)照組和處理組土壤中不同菌群所占比例Fig.3 The proportion of different flora in original, control and treatment groups

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的土壤物理消毒方法消毒效果往往只停留在土壤表層[22]。本研究檢驗(yàn)了臭氧水對(duì)于土壤消毒的作用效果對(duì)土壤微生物的消減效果至少可達(dá)15～20 cm的土層，可以覆蓋番茄黃瓜等常見(jiàn)蔬菜作物的根際土壤，是一種有效的土壤消毒措施。

臭氧難溶于水且極不穩(wěn)定[10]，出于對(duì)臭氧水使用安全和臭氧水制備難度方面的考慮，研究中設(shè)計(jì)了較低濃度臭氧水重復(fù)灌溉的試驗(yàn)。在此土壤條件下，本研究得到采用ρ(O3)=5 mg/L的臭氧水3次澆灌的殺菌效果顯著高于ρ(O3)=20 mg/L的臭氧水澆灌1次效果的結(jié)果。與已有研究結(jié)論相似，即采用低濃臭氧水進(jìn)行多次澆灌處理，澆灌次數(shù)的增加可以促進(jìn)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果和作物的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)更好的土傳病害防治效果[23-24]。由此可知，在生產(chǎn)中可采用低濃度臭氧水重復(fù)澆灌的方法，既可以降低作業(yè)難度，減少對(duì)工作人員和植物的傷害，又可以實(shí)現(xiàn)更好地土壤消毒效果。

在此土壤條件下，本研究結(jié)果顯示ρ(O3)=20 mg/L 的高濃度臭氧水澆灌消減效果是最好的，除了間隔3 d澆灌第60天真菌減退率和間隔7 d澆灌第60天線(xiàn)蟲(chóng)減退率略低，其余均高于其他濃度處理。但臭氧水濃度過(guò)高可能破壞植物的根系，植物根系組織的修復(fù)能力難以抵抗高濃度臭氧水的脅迫傷害，從而出現(xiàn)高濃度臭氧水處理的植物生長(zhǎng)量低于較低濃度臭氧水處理的現(xiàn)象[23]。除間隔10 d澆灌第30天和第60天對(duì)放線(xiàn)菌消減效果ρ(O3)=20 mg/L 區(qū)顯著高于ρ(O3)=15 mg/L區(qū)，其他并未出現(xiàn)顯著性差異。同時(shí)，制備高濃度臭氧水所耗費(fèi)電能多成本相對(duì)較高。綜合考慮，選用ρ(O3)=10～15 mg/L的臭氧水澆灌最適宜。而不同種類(lèi)的微生物對(duì)澆灌時(shí)間間隔的反應(yīng)不同，間隔7～10 d澆灌，可達(dá)到更好的消減細(xì)菌、真菌和線(xiàn)蟲(chóng)效果，間隔3～7 d澆灌可達(dá)到更好的放線(xiàn)菌消減效果。消減不同種類(lèi)微生物的適宜澆灌間隔不同，與不同微生物的繁殖速度和生長(zhǎng)曲線(xiàn)相關(guān)。綜上，用ρ(O3)=10～15 mg/L的臭氧水間隔7 d澆灌1次，消毒效果較好，利用該制度進(jìn)行臭氧水澆灌用于土壤消毒后60 d內(nèi)，仍可保持較好的殺菌消毒效果。

從石灰氮和臭氧水對(duì)土壤細(xì)菌的殺滅情況看，對(duì)照組對(duì)土壤細(xì)菌的殺滅率比處理組的殺滅率低，分析認(rèn)為這與澆灌臭氧水的pH有關(guān)。這可能是由于土壤中的細(xì)菌、真菌等微生物對(duì)pH4.0弱酸性水的耐受性比更低，因此用弱酸性的臭氧水澆灌土壤可以從微生物對(duì)弱酸環(huán)境耐受性低和臭氧的氧化殺菌兩個(gè)方面來(lái)保證土壤消毒效果[25]。此外，在原始土壤和臭氧水處理組土壤樣品的測(cè)序結(jié)果中，本研究選擇含量在1%以上的益生菌進(jìn)行分析和比較。結(jié)果顯示，原始土壤細(xì)菌含量總和為5.2%；處理組土壤細(xì)菌含量總和為7.4%。臭氧水處理提升了土壤中硝酸菌屬和亞硝酸菌屬2種硝化細(xì)菌的比例促進(jìn)土壤消化作用，使土壤中芽孢桿菌比例增加提高作物的抗性。

因此，在本試驗(yàn)的條件下，采用臭氧水灌溉溫室土壤，用于防治土傳病害有可行性。后續(xù)研究及應(yīng)用仍需注意幾方面問(wèn)題：首先，應(yīng)進(jìn)行必要的具體的病害感染現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證臭氧水實(shí)際防治病害的效果；其次，臭氧水可以迅速殺滅病原微生物，但不具選擇性，在應(yīng)用中可能會(huì)造成有益微生物的減少，可適當(dāng)?shù)氖褂糜幸嫖⑸锞鷦┗蚴褂媒】档挠袡C(jī)肥，來(lái)提升土壤中有益菌數(shù)量。另外，臭氧水制備中產(chǎn)生的逸散臭氧可能會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染，在后續(xù)實(shí)際應(yīng)用中，可以在臭氧水制備設(shè)備的出氣口安裝含有催化劑的過(guò)濾網(wǎng)，將逸散臭氧迅速轉(zhuǎn)化為氧氣，從而減少臭氧逸散對(duì)人員和環(huán)境的傷害。