曾 棋 黃聞霆 池 海 王勝男 姜 峰 李天忠 程玉琴

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，北京 100193)

病毒病是影響梨果產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。據(jù)報(bào)道，有21種病毒可侵染梨樹(shù)[1]。最近在我國(guó)又發(fā)現(xiàn)了1種侵染梨樹(shù)的新病毒，暫命名為梨褪綠葉斑伴隨病毒(pear chlorotic leaf spot-associated virus)[2]。研究表明蘋(píng)果莖溝病毒(apple stem grooving virus, ASGV)、蘋(píng)果莖痘病毒(apple stem pitting virus, ASPV)和蘋(píng)果褪綠葉斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)是梨樹(shù)上發(fā)生最普遍的3種重要病毒[3]。此外，蘋(píng)果銹果類病毒(apple scar skin viroid，ASSVd)在世界各地梨栽培地區(qū)也普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響梨果產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。

病毒和類病毒在梨樹(shù)上通常為復(fù)合侵染[5]，帶毒無(wú)性繁殖材料和帶毒嫁接是其傳播的主要途徑。因此摸清現(xiàn)有梨樹(shù)上主要病毒和類病毒的發(fā)生情況對(duì)于防控梨病毒病害具有十分重要的意義。

我國(guó)梨栽培面積和產(chǎn)量均為世界第一，其中河北、安徽、河南、新疆、遼寧、陜西和山東等主產(chǎn)區(qū)的種植面積占我國(guó)梨種植總面積的一半左右，產(chǎn)量約為我國(guó)梨總產(chǎn)量的64%[6]。梨也是北京地區(qū)出產(chǎn)的第二大水果。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年北京梨栽培面積為6 700 hm2，產(chǎn)量達(dá)9.07萬(wàn)t[6]，梨產(chǎn)業(yè)已成為帶動(dòng)北京農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)之一。但是目前對(duì)于該地區(qū)梨樹(shù)感染病毒和類病毒的情況尚不清楚。由于ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd在世界各地梨樹(shù)栽培地區(qū)發(fā)生普遍，因此，本研究利用RT-PCR方法對(duì)采自北京市重要梨果生產(chǎn)區(qū)縣的157份梨樹(shù)樣品進(jìn)行ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd檢測(cè)，旨在評(píng)估北京地區(qū)梨樹(shù)的健康狀況并明確感染病毒和類病毒的主要種類，以期為管理和規(guī)范梨苗木生產(chǎn)和健全苗木檢疫制度提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

陽(yáng)性對(duì)照為已知感染ASGV+ASPV+ACLSV+ASSVd的‘冬蜜’和‘碭山酥梨’，栽種在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)基地。陰性對(duì)照為本課題組保存的‘紅寶石’和杜梨脫毒組培苗。

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(EASY spin plant RNA extracting kit)購(gòu)自北京博邁德基因工程技術(shù)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司；PCR預(yù)混液(2×TaqMasterMix)購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品采集

2019年和2020年的10月下旬在北京市門頭溝、大興和海淀區(qū)的10個(gè)梨園中采集了157份樣品，包括‘京白梨’、‘鴨梨’、‘園黃梨’、‘豐水梨’、‘玉露香’、‘黃冠’和‘翠冠’等51個(gè)栽培品種。門頭溝區(qū)的東山和王平等4個(gè)果園的梨品種均為‘京白梨’，樹(shù)齡大多為15年左右，每個(gè)果園隨機(jī)選擇12～15 棵樹(shù)采集樣品，其中在東山果園還另采集2株百年樹(shù)齡樣品。大興和海淀區(qū)6個(gè)梨園的梨樹(shù)樹(shù)齡為1～20年，在每個(gè)果園對(duì)每個(gè)梨品種隨機(jī)選取1棵梨樹(shù)進(jìn)行樣品采集。

從每棵梨樹(shù)上采集一年生枝條2份，隨后在室內(nèi)分別剝?nèi)悠返捻g皮部組織并保存在-80 ℃冰箱中待用。

在所有調(diào)查的果園中，梨樹(shù)均為嫁接苗，砧木是杜梨。本研究進(jìn)行調(diào)查和采樣的時(shí)間為10月底，絕大多數(shù)果園的梨樹(shù)葉子已開(kāi)始變黃，有些果園的梨樹(shù)甚至開(kāi)始落葉，同時(shí)由于病毒在梨樹(shù)上通常為潛隱性侵染，因此在采樣時(shí)未能觀察到梨樹(shù)上有明顯病毒病癥狀。

1.2.2檢測(cè)引物

根據(jù)NCBI上ACLSV復(fù)制酶(Putative viral replicase)基因序列信息，自行設(shè)計(jì)檢測(cè)引物。ASGV、ASPV和ASSVd的檢測(cè)引物均參考已發(fā)表文獻(xiàn)[7-9]。引物由生工生物工程有限公司合成。引物名稱、序列、退火溫度和擴(kuò)增片段大小如表1所示。

1.2.3總RNA提取

將一年生梨枝條韌皮部組織(100 mg)加液氮研磨成粉末。將粉末轉(zhuǎn)移到2 mL的離心管中，然后按照RNA提取試劑盒的操作手冊(cè)提取總RNA。

1.2.4RT-PCR

在0.2 mL的PCR管中加入8 μL總RNA、8 μL RNase free H2O和4 μL 5×TRUE RT MasterMix(試劑盒自帶)，用移液槍吸打混勻。25 ℃ 孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。

反轉(zhuǎn)錄后隨即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL的擴(kuò)增體系中包括2 μL cDNA、2. 5 μL 10×buffer緩沖液、2 μL dNTP、各0. 5 μL的正向和反向引物(20 μmol/L)、0. 2 μL DNA聚合酶(5 U/μL)及17. 3 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54～60 ℃退火30 s (退火溫度詳見(jiàn)表1)；72 ℃延伸24～45 s(根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度確定)，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)選取部分樣品的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測(cè)ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd

利用RT-PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照梨樹(shù)樣品(‘冬蜜’和‘碭山酥梨’)中的病毒和類病毒，陰性對(duì)照為‘紅寶石’和杜梨脫毒組培苗。由圖1可知，在2個(gè)陽(yáng)性樣品‘冬蜜’和‘碭山酥梨’中均擴(kuò)增到ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的特異性條帶，而在陰性對(duì)照‘紅寶石’和杜梨脫毒組培苗中則未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。為了進(jìn)一步確定檢測(cè)結(jié)果，將陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示這些擴(kuò)增產(chǎn)物分別為病毒和類病毒對(duì)應(yīng)的基因片段。上述結(jié)果表明，本研究所采用的RT-PCR方法可特異性地檢測(cè)梨樹(shù)樣品中的ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd。

M， DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100～2 000 bp)；泳道1～4，分別為ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的檢測(cè)結(jié)果。M, DNA molecular weight marker (100-2 000 bp). Lanes 1-4, PCR products for detection of ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd, respectively.圖1 RT-PCR檢測(cè)梨樹(shù)樣品ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVdFig.1 Detection of ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd in pear samples by RT-PCR

2.2 北京地區(qū)梨樹(shù)樣品病毒和類病毒的檢測(cè)結(jié)果分析

利用RT-PCR對(duì)北京地區(qū)采集的所有梨樹(shù)樣品進(jìn)行ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd檢測(cè)。其中在檢測(cè)采自門頭溝區(qū)4個(gè)果園的51份‘京白梨’樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一果園的不同‘京白梨’植株，其感染病毒的種類也不盡相同。以采自門頭溝區(qū)東山果園的樣品為例，對(duì)9個(gè)‘京白梨’樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(圖2)，其中泳道1和3分別是采自2株百年樹(shù)齡‘京白梨’的樣品，泳道2、泳道4～9分別為采自不同株15年樹(shù)齡梨樹(shù)的樣品。圖2(a)顯示了從各樣品所提取的總RNA，其28S和18S條帶清晰，且前者寬度約為后者的兩倍；圖2(b)顯示了在各樣品中均擴(kuò)增到內(nèi)參基因actin的特異性條帶，這些結(jié)果再次表明RT-PCR檢測(cè)體系的可靠性。由圖2(c)～(f)可知，9個(gè)‘京白梨’樣品所感染的病毒種類并不相同。其中2株百年樹(shù)齡老樹(shù)(泳道1和3)和1株15樹(shù)齡梨樹(shù)(泳道7)均感染了ASGV、ASPV、ACLSV 和ASSVd。在其它6株15年樹(shù)齡的‘京白梨’中， 1株(泳道8)感染了ASGV，3株(泳道5、6和9)感染了ASGV+ACLSV，1株(泳道2)感染了ASGV+ASSVd，1株(泳道4)則感染ASGV+ACLSV+ASSVd。采自門頭溝區(qū)其它3個(gè)果園的‘京白梨’樣品也顯示出相似的檢測(cè)結(jié)果(表2)。

(a)總RNA電泳圖;(b)～(f)分別為擴(kuò)增內(nèi)參基因actin、ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；M,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P,陽(yáng)性樣品(‘冬蜜’)；N,陰性對(duì)照(‘紅寶石’脫毒組培苗)；泳道1～9，分別為采自門頭溝區(qū)東山果園的9個(gè)‘京白梨’樣品。(a) Total RNA; (b)-(f) PCR products for detection of actin (the internal reference gene), ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd, respectively. M, DNA molecular weight marker. P, positive control sample (‘Dongmi’). N, negative control sample (virus-free pear ‘Hongbaoshi’ plantlets). Lanes 1-9, nine ‘Jingbaili’ samples collected from Dongshan orchard in Mentougou district.圖2 RT-PCR檢測(cè)部分‘京白梨’樣品病毒和類病毒Fig.2 RT-PCR detection of viruses and viroids in several pear (‘jingbaili’) samples

表2 門頭溝不同果園‘京白梨’樣品中病毒和類病毒的發(fā)生情況分析Table 2 Occurrence of viruses and viroids in pear (‘Jingbaili’) samples collected from different orchards

對(duì)大興、海淀及門頭溝區(qū)果園中的‘翠冠’,‘黃冠’,‘玉露香’和‘京白梨’等51個(gè)品種總計(jì)157份梨樹(shù)樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析(表3)，北京地區(qū)梨樹(shù)上普遍感染了ASGV，檢出率高達(dá)91.1%。其中采自門頭溝區(qū)的51個(gè)‘京白梨’樣品均檢出ASGV，檢出率為100%；采自大興區(qū)的45個(gè)樣品和海淀區(qū)的61個(gè)樣品中，該病毒的檢出率分別為97.8%和78.7%。

北京地區(qū)梨樹(shù)ASPV和ASSVd的檢出率分別為59.2%和54.8%，其中采自海淀區(qū)的樣品中ASPV和ASSVd的檢出率相對(duì)較高，分別為73.8%和65.6%，而在大興和門頭溝區(qū)的梨樹(shù)樣品中ASPV和ASSVd的檢出率相對(duì)較低。梨樹(shù)樣品中ACLSV的檢出率較低，為35.7%，但該病毒的檢出率在不同采樣地點(diǎn)間的差異較大。其中在門頭溝區(qū)‘京白梨’樣品中，該病毒的檢出率高達(dá)92.2%，而在大興和海淀區(qū)樣品中的檢出率僅為8.8%和8.2%。上述結(jié)果表明，ASGV是侵染北京地區(qū)梨樹(shù)的最主要病毒種類，其次為ASPV和ASSVd，ACLSV的發(fā)生率相對(duì)較低，但在門頭溝區(qū)‘京白梨’品種上發(fā)生普遍。

本研究在所調(diào)查的大多數(shù)果園中，對(duì)每一梨品種進(jìn)行隨機(jī)抽樣檢測(cè)，由于同一果園相同品種的不同植株之間可能攜帶不同的病毒種類(圖2和表2)，因此對(duì)本次調(diào)查的大多數(shù)梨品種而言，分析這些品種間帶毒率的差異可能沒(méi)有太大的參考價(jià)值。但少數(shù)幾個(gè)梨主栽品種如‘京白梨’、‘翠冠’、‘玉露香’和‘黃冠’等所檢測(cè)的樣品數(shù)相對(duì)較多，故對(duì)這4個(gè)品種病毒和類病毒的發(fā)生情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知，ASGV和ASPV是侵染‘翠冠’和‘玉露香’的主要病毒種類，而ACLSV和ASSVd沒(méi)有或極少檢出?！S冠’品種上病毒和類病毒的發(fā)生情況與‘翠冠’和‘玉露香’類似，只是ASSVd的檢出率相對(duì)較高。‘京白梨’則普遍感染了ASGV和ACLSV，同時(shí)ASPV和ASSVd的檢出率也分別達(dá)到43.1%和49.0%。這些結(jié)果表明，不同梨品種所感染的病毒種類存在明顯差異，且‘京白梨’感染病毒和類病毒的情況更為嚴(yán)重。

表3 北京地區(qū)梨樹(shù)病毒和類病毒發(fā)生情況分析Table 3 Occurrence of viruses and viroids in pear plants in Beijing

表4 4個(gè)梨主栽品種病毒和類病毒發(fā)生情況統(tǒng)計(jì)Table 4 Occurrence of viruses and viroids in four popular pear cultivars

2.3 北京地區(qū)梨樹(shù)上病毒和類病毒復(fù)合侵染情況

對(duì)北京地區(qū)梨樹(shù)樣品中病毒和類病毒復(fù)合侵染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表5。在所檢測(cè)的157份樣品中，有24份樣品只檢出1種病毒或類病毒。其中18份樣品只檢出ASGV，4份樣品只檢測(cè)出ASPV，其他2份樣品分別只檢測(cè)出ACLSV和ASSVd。其余133份樣品則為多種病毒(包括類病毒)的復(fù)合侵染，占樣品總數(shù)的84.7%。其中受到ASGV+ASPV+ASSVd復(fù)合侵染的樣品數(shù)量最多，占所檢樣品數(shù)的25.5%；受到ASGV+ASPV或ASGV+ACLSV侵染的各有11.5%的樣品；各有10.2%的樣品分別感染了ASGV+ASPV+ACLSV+ASSVd或ASGV+ASSVd。此外，有5.8%、5.1%、2.5%和2.5%的樣品分別受ASGV+ACLSV+ASSVd、ASGV+ASPV+ACLSV、ASPV+ASSVd和ASPV+ACLSV的復(fù)合侵染。以上說(shuō)明北京地區(qū)梨樹(shù)受到病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象遠(yuǎn)比單一侵染的更普遍，該結(jié)果為北京地區(qū)梨病毒病防控提供了參考。

表5 北京地區(qū)梨樹(shù)病毒(類病毒)單一侵染和復(fù)合侵染情況Table 5 Occurrence of single and mixed infection in pear plants in Beijing

3 討 論

ASGV、ASPV和ACLSV是侵染梨樹(shù)的3種主要病毒種類，但這幾種病毒在不同國(guó)家或地區(qū)梨園中的發(fā)生率有明顯區(qū)別。如在主栽東方梨品種的韓國(guó)，ASGV是侵染該國(guó)梨樹(shù)的最主要病毒種類，檢出率為74.2%，其次為ASPV(34.8%)，而ACLSV則極少檢測(cè)到[10]；在拉脫維亞[11]和突尼斯[12]等主栽西洋梨品種的國(guó)家，ACLSV是最主要的病毒種類；在我國(guó)，楊蕊等[13]用RT-PCR檢測(cè)了天津地區(qū)的梨樹(shù)樣品，結(jié)果表明ACLSV(47.1%)的檢出率最高，其次為ASPV(11.4%)和ASSVd (10%)，而ASGV的檢出率只有8.6%。本研究結(jié)果顯示，ASGV是侵染北京地區(qū)梨樹(shù)的最主要病毒種類，檢出率高達(dá)91.1%，其次為ASPV(59.2%)，ACLSV的檢出率(35.7%)相對(duì)較低。本研究檢測(cè)的梨樹(shù)樣品數(shù)為157份，涉及‘京白梨’、‘鴨梨’、‘園黃梨’、‘豐水梨’、‘玉露香’、‘黃冠’和 ‘翠冠’等51個(gè)栽培品種，而楊蕊等[14]檢測(cè)的梨樹(shù)樣品為70份，只涉及7個(gè)品種，樣本數(shù)量可能是導(dǎo)致調(diào)查結(jié)果出現(xiàn)差異的原因。這表明了今后需開(kāi)展全國(guó)范圍內(nèi)的廣泛和系統(tǒng)的調(diào)查，以摸清我國(guó)梨樹(shù)病毒和類病毒的發(fā)生情況。

北京地區(qū)梨樹(shù)樣品中ASSVd的檢出率高達(dá)54.8%，該數(shù)值明顯高于韓國(guó)[10]、波黑[14]和希臘[15]等國(guó)報(bào)道的數(shù)據(jù)。雖然目前尚未系統(tǒng)研究ASSVd對(duì)梨品種果實(shí)的危害，但是已有研究表明ASSVd可導(dǎo)致梨品種‘Niitaka’的果實(shí)出現(xiàn)明顯的凹果(Dimpling)病癥, 嚴(yán)重影響梨果品質(zhì)[16]。因此鑒于ASSVd對(duì)梨果實(shí)的潛在危害，在北京地區(qū)進(jìn)行梨樹(shù)苗木繁育和調(diào)運(yùn)過(guò)程中，相關(guān)部門需加強(qiáng)對(duì)ASSVd的檢測(cè)。

本研究發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)的樣品均受到病毒侵染，而且有84.7%的梨樹(shù)樣品受到多種病毒(包括類病毒)的復(fù)合侵染，該數(shù)值顯著高于世界上其他國(guó)家如拉脫維亞[11]和突尼斯[12]等國(guó)家報(bào)道的數(shù)據(jù)。在以后的工作中，需要進(jìn)行更多梨樹(shù)品種和數(shù)量的病毒攜帶情況調(diào)查，從而為苗木生產(chǎn)和繁育提供數(shù)據(jù)支持和指導(dǎo)。

本研究結(jié)果表明‘京白梨’、‘翠冠’、‘玉露香’和‘黃冠’等不同梨品種所攜帶的病毒種類各不相同，這與Pūpola等[11]報(bào)道一致。需要引起重視的是，本研究通過(guò)對(duì)門頭溝區(qū)4個(gè)果園單一栽培品種(‘京白梨’)的廣泛調(diào)查發(fā)現(xiàn)，即使是同一果園同一品種的不同梨樹(shù)，所感染的病毒種類也存在著明顯差異。由于無(wú)法得知這些果園接穗和砧木的來(lái)源及其當(dāng)時(shí)帶毒情況，目前尚不清楚造成這種結(jié)果的確切原因。有報(bào)道表明，蘋(píng)果和梨種子也是傳播病毒(類病毒)的途徑之一[17-20]，因此推測(cè)砧木(杜梨實(shí)生苗)帶毒可能是同一果園內(nèi)的不同‘京白梨’樹(shù)感染不同病毒種類的原因；另一個(gè)原因可能是‘京白梨’接穗來(lái)源不同而攜帶不同病毒種類所致。在以后的研究中，需要對(duì)更多果園中其它梨品種的不同植株進(jìn)行病毒和類病毒檢測(cè)，以分析這種現(xiàn)象是否具有普遍性。

4 結(jié) 論

針對(duì)北京市重要梨果生產(chǎn)區(qū)的157份樣品進(jìn)行ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)梨樹(shù)普遍受到病毒和類病毒的復(fù)合侵染。其中ASGV+ASPV+ASSVd復(fù)合侵染率最高。侵染北京地區(qū)梨樹(shù)的最主要病毒種類是ASGV。