劉 雙 趙 新 李瑞環(huán) 劉 娜 蘭青闊 檀建新 王 永,*

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，天津 300381；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

自1996年國(guó)際上首次種植轉(zhuǎn)基因作物至今已有24年的時(shí)間。轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展突飛猛進(jìn)，很多國(guó)家和地區(qū)均實(shí)施了標(biāo)識(shí)管理制度，并設(shè)定了閾值。如歐盟實(shí)施強(qiáng)制性的轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度[1]，我國(guó)目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也實(shí)施強(qiáng)制標(biāo)識(shí)制度。目前，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的方法主要是基于核酸檢測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)[2]、核酸雜交技術(shù)[3]和基因芯片技術(shù)[4]；基于蛋白質(zhì)檢測(cè)的Western Blot[5]和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[6]等。其中應(yīng)用最廣泛的是基于核酸檢測(cè)的普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法。我國(guó)已經(jīng)研制了‘ZH 10-6’大豆的定性PCR檢測(cè)方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[7]已初步建立，但是其數(shù)字PCR定量方法尚未見(jiàn)報(bào)道。相對(duì)于轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測(cè)方法，定量PCR檢測(cè)方法不僅可以檢測(cè)產(chǎn)品含有的轉(zhuǎn)基因成分，而且可以確定轉(zhuǎn)基因成分的含量，更加有助于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管。

數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)是在實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的微量DNA分子定量檢測(cè)新技術(shù)。dPCR是將PCR體系分配到足夠小的反應(yīng)單元中，實(shí)現(xiàn)每個(gè)反應(yīng)單元只有單個(gè)模板分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再采用泊松分布原理，根據(jù)陽(yáng)性微滴與陰性微滴數(shù)的比例計(jì)算目標(biāo)分子拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量[8-10]。該方法降低了標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響等問(wèn)題，降低了基體效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了PCR擴(kuò)增的樣品分離，消除了本底信號(hào)的影響，提高了低拷貝DNA的擴(kuò)增靈敏度[11]。相比實(shí)時(shí)熒光PCR，數(shù)字PCR具有更好的測(cè)量獨(dú)立性，且無(wú)需任何校準(zhǔn)物，具有更高的特異性、靈敏度、精確性和穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆品種‘ZH 10-6’是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所研發(fā)的轉(zhuǎn)G2-EPSPS和GAT基因耐除草劑大豆新品種[12]。研發(fā)人采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將整合有G2-EPSPS和GAT2個(gè)基因的獨(dú)立表達(dá)載體DNA導(dǎo)入大豆受體中，通過(guò)多代篩選獲得對(duì)草甘膦具有抗性的‘ZH 10-6’轉(zhuǎn)化體，在我國(guó)具有重要產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景，已獲得轉(zhuǎn)基因安全證書。但是其數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以‘ZH 10-6’特異性序列為靶標(biāo)，通過(guò)對(duì)引物探針濃度的優(yōu)化確定擴(kuò)增體系，并對(duì)其特異性、靈敏度和準(zhǔn)確度等進(jìn)行測(cè)試，旨在建立該轉(zhuǎn)基因大豆品種‘ZH 10-6’的微滴式數(shù)字PCR精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法，以期為該轉(zhuǎn)基因大豆品種的安全評(píng)價(jià)、行政監(jiān)管和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供重要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆品種‘ZH 10-6’；非轉(zhuǎn)基因大豆品種‘ZH 10’；轉(zhuǎn)基因玉米品種混合樣(‘Bt 11’、‘Bt 176’、‘MON 810’、‘MON 863’、‘GA 21’、‘NK 603’、‘T 25’、‘TC 1507’、‘MON 89034’、‘MON 88017’、‘59122’、‘MIR 604’、‘3272’、‘MON 87460’、‘MIR 162’、‘DAS 40278-9’、‘雙抗12-5’、‘IE09S034’、‘C0030.3.5’、‘C0010.3.7’、‘4114’、‘MON 87427’和‘5307’)；轉(zhuǎn)基因大豆品種混合樣(‘GTS 40-3-2’、‘MON 89788’、‘CV 127’、‘A 5547-127’、‘A 2704-12’、‘305423’、‘356043’、‘MON 88302’、‘73496’、‘MON 87769’、‘MON 87705’、‘FG 72’、‘DAS 68416-4’和‘SHZD 32-1’)；轉(zhuǎn)基因油菜品種混合樣(‘Ms 1’、‘Ms 8’、‘RF 1’、‘RF 2’、‘RF 3’、‘T 45’、‘oxy 235’、‘Topas 19/2’、‘MON 88302’和‘73496’)；轉(zhuǎn)基因水稻品種混合樣(‘TT 51-1’、‘科豐6號(hào)’、‘M 12’、‘科豐8號(hào)’、‘科豐2號(hào)’、‘G6H1’和‘T1 C-19’)；轉(zhuǎn)基因棉花品種混合樣(‘MON 531’、‘MON 1445’、‘MON 15985’、‘MON 88913’、‘GHB 614’、‘COT 102’)。以上樣品均由本實(shí)驗(yàn)室收集保存。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取

以轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆品種‘ZH 10-6’新鮮葉片為材料，按照德國(guó)QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒純化獲得基因組DNA，利用NanoDrop ND-1000核酸蛋白定量?jī)x(Thermo Scientific公司，美國(guó))測(cè)定DNA質(zhì)量并將其稀釋至統(tǒng)一濃度25 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物和探針設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的外源基因插入位置為第17號(hào)染色體，插入位點(diǎn)為含有G2-EPSPS和GAT2個(gè)基因的完整表達(dá)框，以及只含G2-EPSPS基因的表達(dá)框，不同外源基因片段之間以大豆基因組DNA片段相連接(圖1)。

根據(jù)轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH10-6’外源插入片段的2個(gè)5′端側(cè)翼序列，采用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)了多種引物探針組合，引物由上海生工有限公司合成，引物探針信息，見(jiàn)表1。

圖1 轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH10-6’外源基因插入位點(diǎn)Fig.1 Insertion site of foreign gene in transgenic herbicide-tolerant soybean ‘ZH10-6’

表1 微滴式數(shù)字PCR引物探針序列信息Table 1 Sequence information of droplet digital PCR primer probe

1.2.3反應(yīng)體系和條件

PCR反應(yīng)的總體積為20 μL，包括BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes 10 μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，10 μmol/L探針1 μL，25 ng/μL DNA模板1 μL，用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)充至20 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)；98 ℃酶失活10 min，1個(gè)循環(huán)。

1.2.4引物探針初篩

使用上述通用體系和程序，以轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’基因組DNA為模板，采用合成的引物探針組合配制20 μL的PCR體系，將體系混勻后轉(zhuǎn)移至微滴生成卡槽的樣品列小室中，在oil列加入70 μL的微滴生成油，蓋上膠墊放入微滴生成器BIO-RAD QX100 Droplet Generator(Bio-Rad公司，美國(guó))中由儀器自主生成微滴，再將生成的微滴小心轉(zhuǎn)移至96孔板中，175 ℃于BIO-RAD PX1 PCR Plate Sealer(Bio-Rad公司，美國(guó))熱封膜，最后置于Analytik jena Easy Cycler梯度PCR儀(Bio-Rad公司，美國(guó))中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔板放入微滴分析儀BIO-RAD QX100 Droplet Reader(Bio-Rad公司，美國(guó))中讀取信號(hào)，并進(jìn)行分析。篩選陽(yáng)性和陰性微滴界限區(qū)分清晰且僅以轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’基因組DNA為模板時(shí)，生成有陽(yáng)性微滴的引物探針組合，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2個(gè)平行。

1.2.5PCR反應(yīng)體系和程序優(yōu)化

根據(jù)BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes推薦的引物探針體積，分別設(shè)置5個(gè)濃度梯度的引物探針(體系終濃度為0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μmol/L)對(duì)微滴式數(shù)字PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，篩選出陽(yáng)性與陰性微滴界限清楚，且熒光信號(hào)相對(duì)較高的引物探針組合作為本研究的最優(yōu)反應(yīng)體系。

分別設(shè)置6個(gè)梯度的退火溫度(54、56、58、60、62 和64 ℃)，對(duì)微滴式數(shù)字PCR程序進(jìn)行優(yōu)化，篩選出陽(yáng)性微滴與陰性微滴界限清楚，且熒光信號(hào)相對(duì)較高的引物探針組合作為本方法的最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.2.6特異性測(cè)試

以轉(zhuǎn)基因玉米混合樣，轉(zhuǎn)基因大豆混合樣，轉(zhuǎn)基因油菜混合樣，轉(zhuǎn)基因水稻混合樣，轉(zhuǎn)基因棉花混合樣，非轉(zhuǎn)基因大豆樣品的基因組DNA為模板，采用已優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2個(gè)平行。

1.2.7定量檢測(cè)線性動(dòng)態(tài)范圍測(cè)定

將轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的基因組DNA(100%)用緩沖液稀釋至50.000%、10.000%、2.000%、0.400%、0.080%和0.016% 共7個(gè)濃度梯度，采用優(yōu)化后的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增以確定本方法的線性動(dòng)力范圍，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。

1.2.8檢出限和定量限驗(yàn)證

以定量檢測(cè)線性動(dòng)態(tài)范圍測(cè)定中線性范圍下限且RSD≤25%的基因組DNA濃度為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置10個(gè)平行，統(tǒng)計(jì)PCR反應(yīng)結(jié)果確定本方法的定量限(limit of quantification, LOQ)；采用可以穩(wěn)定檢測(cè)的基因組DNA濃度，設(shè)置10個(gè)重復(fù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)10個(gè)平行PCR反應(yīng)的結(jié)果，確定本方法的檢出限(limit of detection, LOD)。

1.2.9方法適用性測(cè)試

制備轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’含量分別為100.00%、5.00%和1.00%的樣品：以非轉(zhuǎn)基因大豆‘ZH 10’和轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’進(jìn)行質(zhì)量濃度配比混合，得到已知含量的定量測(cè)試樣品。提取其基因組DNA作為模板，進(jìn)行數(shù)字PCR擴(kuò)增，通過(guò)計(jì)算得到測(cè)試樣品的含量，對(duì)方法的定值適用性進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物初篩

采用通用體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步篩選確定了陽(yáng)性微滴與陰性微滴界限區(qū)分明顯且熒光信號(hào)值相對(duì)較高的引物探針組合2-5-F3/R3/P3(圖2)，作為本研究的引物探針進(jìn)行后續(xù)的體系優(yōu)化和驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.2 微滴式數(shù)字PCR體系優(yōu)化

由表2、圖3和圖4可知，微滴式數(shù)字PCR體系中引物和探針的終濃度為0.5 μmol/L，退火溫度56 ℃時(shí)，陽(yáng)性微滴與陰性微滴界限清楚，且熒光信號(hào)值較高，確定擴(kuò)增體系的引物終濃度為0.5 μmol/L，探針終濃度為0.5 μmol/L。

2.3 特異性測(cè)試

由圖5可知，僅以轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的基因組DNA為模板時(shí)，生成有陽(yáng)性微滴，且陽(yáng)性微滴與陰性微滴界限清楚，而以其他轉(zhuǎn)基因作物混樣和非轉(zhuǎn)基因大豆的基因組DNA為模板時(shí)，沒(méi)有陽(yáng)性微滴生成，表明本研究所篩選的引物探針特異性良好，可以用于后續(xù)測(cè)定。

1和2，引物組合1-5-F1/R1/P1；3和4，引物組合1-5-F1/R2/P1；5和6，引物組合1-5-F2/R1/P2；7和8，引物組合1-5-F2/R2/P2；9和10，引物組合2-5-F1/R1/P1；11和12，引物組合2-5-F1/R2/P2；13和14，引物組合2-5-F2/R1/P1；15和16，引物組合2-5-F2/R2/P2；17和18，引物組合2-5-F3/R3/P3。1 and 2， primer combination 1-5-F1/R1/P1; 3 and 4， primer combination 1-5-F1/R2/P1; 5 and 6， primer combination 1-5-F2/R1/P2; 7 and 8， primer combination 1-5-F2/R2/P2; 9 and 10， primer combination 2-5-F1/R1/P1; 11 and12， primer combination 2-5-F1/R2/P2; 13 and 14， primer combination 2-5-F2/R1/P1; 15 and 16， primer combination 2-5-F2/R2/P2; 17 and 18， primer combination 2-5-F3/R3/P3.圖2 微滴式數(shù)字PCR引物初步篩選結(jié)果Fig.2 Preliminary screening results of droplet digital PCR primers

表2 微滴式數(shù)字PCR體系優(yōu)化拷貝數(shù)結(jié)果Table 2 Optimized copy number results of droplet digital PCR system

2.4 定量線性范圍測(cè)定

由表3和圖6可知，大豆內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’特異性序列標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均>0.99。在模板含量為66.0個(gè)拷貝時(shí)，大豆內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’特異性序列的RSD≤25.00%，初步確定本研究的定量檢測(cè)下限為66.0個(gè)拷貝。

1，2，3, 4和5分別是引物濃度0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 μmol/L。1， 2， 3, 4 and 5 indicate primer concentration 0.3， 0.4， 0.5， 0.6 and 0.7 μmol/L respectively.圖3 微滴式數(shù)字PCR體系優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization results of droplet digital PCR system

2.5 檢出限和定量限驗(yàn)證

由表4可知，10次重復(fù)內(nèi)源基因Lectin的RSD為19.44%，轉(zhuǎn)基因大豆‘ZH 10-6’特異性序列的RSD為16.00%，內(nèi)源基因和特異性序列擴(kuò)增RSD均≤25.00%，故確定定量限為66.0個(gè)拷貝。

1和2，54 ℃；3和4，56 ℃；5和6，58 ℃；7和8，60 ℃；9和10，62 ℃；11和12，64 ℃。圖4 微滴式數(shù)字PCR程序退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization annealing temperature results of droplet digital PCR program

1和2，陽(yáng)性對(duì)照；3和4，轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’；5和6，非轉(zhuǎn)基因大豆樣品；7和8，轉(zhuǎn)基因玉米混樣；9和10，其他轉(zhuǎn)基因大豆混樣；11和12，轉(zhuǎn)基因油菜混樣；13和14，轉(zhuǎn)基因水稻混樣；15和16，轉(zhuǎn)基因棉花混樣；17和18，陰性對(duì)照。1 and 2， positive control; 3 and 4， genetically modified herbicide-tolerant soybean ‘ZH 10-6’; 5 and 6， non-transgenic soybean sample; 7 and 8， genetically modified corn mixed samples; 9 and 10， other genetically modified soybean mixed samples; 11 and 12， genetically modified rapeseed mixed samples; 13 and 14， genetically modified rice mixed sample; 15 and 16， genetically modified cotton mixed sample; 17 and 18， negative control.圖5 微滴式數(shù)字PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Specific detection results of droplet digital PCR

表3 微滴式數(shù)字PCR定量線性范圍測(cè)試結(jié)果Table 3 Test results of quantitative linear range of droplet digital PCR

圖6 大豆內(nèi)源Lectin(a)和轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH10-6’特異性序列(b)基因定量線性范圍PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 The quantitative linear range PCR amplification results of soybean endogenous Lectin (a) and genetically modified herbicide-tolerant soybean‘ZH10-6’ specific sequence (b)

以含量為13.0個(gè)拷貝的DNA為模板擴(kuò)增時(shí)，10次擴(kuò)增均有陽(yáng)性微滴生成；以含量為2.6個(gè)拷貝的DNA為模板擴(kuò)增時(shí)，10個(gè)重復(fù)中有8次檢測(cè)達(dá)到陽(yáng)性微滴，2次未檢測(cè)到陽(yáng)性微滴，確定檢出限為13.0個(gè)拷貝，見(jiàn)表4。

2.6 適用性測(cè)試結(jié)果

由表5和圖7可知，模擬樣品定值實(shí)際結(jié)果與預(yù)計(jì)結(jié)果偏差均在25%以內(nèi)，表明本方法的定值適用性良好。

表4 微滴式數(shù)字PCR定量限(LOQ)和檢出限(LOD)Table 4 Limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD) of the droplet digital PCR

表5 數(shù)字PCR方法適用性測(cè)定Table 5 Applicability determination of digital PCR method

1和2，樣品1內(nèi)源基因；3和4，樣品1外源基因；5和6，樣品2內(nèi)源基因；7和8，樣品2外源基因；9和10，樣品3內(nèi)源基因；11和12，樣品3外源基因。1 and 2， sample 1 endogenous gene; 3 and 4， sample 1 exogenous gene; 5 and 6， sample 2 endogenous gene; 7 and 8， sample 2 exogenous gene; 9 and 10， sample 3 endogenous gene; 11 and 12， sample 3 foreign gene.圖7 數(shù)字PCR方法適用性測(cè)定結(jié)果Fig.7 Applicability test results of digital PCR method

3 討 論

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，多數(shù)國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品均強(qiáng)制規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分含量高于某一閾值時(shí)須進(jìn)行標(biāo)識(shí)，如何精準(zhǔn)測(cè)定轉(zhuǎn)基因成分的含量已經(jīng)成為現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)研究的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。目前，用于分析基因拷貝數(shù)的方法主要有Southern Blot方法、實(shí)時(shí)熒光PCR定量方法和數(shù)字PCR定量方法。

Southern也被稱為凝膠電泳雜交技術(shù)。該方法利用了硝酸纖維素膜或尼龍膜的特性,即可吸附DNA進(jìn)行印跡實(shí)驗(yàn)。首先待測(cè)樣品進(jìn)行凝膠電泳，然后將電泳的DNA條帶轉(zhuǎn)印到膜上，后直接在膜上進(jìn)行被測(cè)DNA和同位素標(biāo)記的探針之間的雜交。最后，通過(guò)放射自顯影設(shè)備來(lái)檢測(cè)雜交結(jié)果，以檢測(cè)DNA樣品中包含的特定DNA序列。Southern印跡法在檢測(cè)靶基因的拷貝數(shù)，鑒定轉(zhuǎn)基因植物，開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記和篩選DNA文庫(kù)中起重要作用。但該項(xiàng)技術(shù)的操作步驟繁雜，要獲得理想的結(jié)果，通常會(huì)花費(fèi)較多的時(shí)間和精力。傳統(tǒng)Southern印跡分析的探針通常用放射性同位素標(biāo)記，但可能會(huì)對(duì)操作人員和環(huán)境造成放射性危害。傳統(tǒng)的Southern Blot方法分析基因拷貝數(shù)操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大且準(zhǔn)確性相對(duì)較差[13]。

實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)定量檢測(cè)方法是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中常用的方法之一。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量分析靶標(biāo)序列含量等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于普通PCR來(lái)說(shuō)，實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)定量檢測(cè)方法檢出限更低。實(shí)時(shí)熒光PCR定量方法分析基因拷貝數(shù)較Southern Blot方法耗時(shí)短，但依賴于標(biāo)準(zhǔn)品，需要同時(shí)構(gòu)建內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)化體特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線，是一種依賴于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)定量分析方法[14-15]，檢測(cè)結(jié)果也存在一定的不確定性。

微滴式數(shù)字PCR精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法是配置PCR體系后，通過(guò)微滴生成器將混勻后的體系生成上萬(wàn)個(gè)油包水微滴，再放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，最后放入微滴讀取儀中讀取陽(yáng)性微滴和陰性微滴的個(gè)數(shù)，從而來(lái)精準(zhǔn)定量靶標(biāo)序列。微滴式數(shù)字PCR精準(zhǔn)定量方法[16]較前2種分析基因拷貝數(shù)的方法，操作更加簡(jiǎn)單，不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，不僅可以更加準(zhǔn)確的定量研究靶標(biāo)序列，而且檢測(cè)時(shí)間更短，結(jié)果由儀器判讀也可避免操作人員的主觀因素，獲取數(shù)據(jù)更加方便，結(jié)果也更加穩(wěn)定可靠，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的絕對(duì)定量[17-18]。微滴式數(shù)字PCR精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法的不足之處是比實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法成本高。

本研究采用的微滴式數(shù)字PCR精準(zhǔn)定量方法用于分析基因的拷貝數(shù)，可有效避免實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增中體系的擴(kuò)增效率、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建的準(zhǔn)確性對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的影響，對(duì)于拷貝數(shù)少的基因定量檢測(cè)更加高效，應(yīng)用前景廣闊[19-20]。本研究建立的轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的數(shù)字PCR精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法可以對(duì)轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’進(jìn)行精準(zhǔn)定量，精確度和準(zhǔn)確度均符合《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第323號(hào)-21-2020轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)數(shù)字PCR方法制定指南》[21]的相關(guān)要求，相較實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法，更適合于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的分析[22]。

4 結(jié) 論

本研究基于轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的5’端邊界序列，建立的轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’數(shù)字PCR檢測(cè)方法特異于‘ZH 10-6’品種檢測(cè)，在相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤25.00%的情況下本方法的檢出限(LOD)為13.0個(gè)拷貝、定量限(LOQ)為66.0個(gè)拷貝；PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板含量與樣品拷貝數(shù)之間線性R2≥0.998，DNA含量線性范圍為0.08%～100.00%。本方法重復(fù)性好，精密度和準(zhǔn)確度均符合相關(guān)要求，適用于對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和食品中轉(zhuǎn)基因大豆‘ZH 10-6’特異性序列的精準(zhǔn)定量分析。