郭 垚，歐 靜，李林盼

（貴州大學林學院，貴州 貴陽 550025）

水因子是限制植物分布地域與生長狀況的主要因素［1］，在植物的生長過程中起到至關重要的作用。在土壤缺水環(huán)境下，植物光合作用會受到抑制。杜鵑（Rhododendron simsiiPlanch）又常被人們稱為“花中西施”，在園林應用和觀賞方面具有較高的價值［2］。菌根是指土壤中某些真菌與植物根的共生體，能夠有效地增加植物的抗逆性，主要分為外生菌根（Ectomycorrhizae，ECM）和內生菌根（Endomy?corrhizaes，ENM）兩大類。菌絲與杜鵑花科植物形成的菌絲節(jié)結構為杜鵑花類菌根（Ericoid mycorrhizas，ERM）［3］，屬于內生菌根。目前，關于杜鵑花類菌根光合特性的研究有桃葉杜鵑（Rhododendron annaeFranch）［4］，華 頂 杜 鵑（Rhododendron huadingense）［5］等，但關于菌根真菌對杜鵑光合特性的影響卻鮮見報道。馬尾松能與外生菌根（Ectomycorrhiza，ECM）形成外生菌根共生體［6］。自然環(huán)境中杜鵑花群落和馬尾松林群落能營造別具一格針葉樹種-杜鵑花模式的喬灌木混交林群落景觀［7］。目前對馬尾松-杜鵑群落的研究很少將真菌接種到杜鵑苗根系來探討真菌對杜鵑光合特性的影響。因此，本試驗從野外群落杜鵑根系分離出菌根真菌進行培養(yǎng)，并按照菌根豐富度篩選出4種菌根真菌菌株與1種馬尾松外生菌根菌株對杜鵑苗進行混合接菌，研究杜鵑菌根苗在不同水分梯度下光合特性的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試內生菌株為自貴州省貴陽市烏當區(qū)及孟關鎮(zhèn)野外馬尾松-杜鵑群落中杜鵑根系分離純化而得的內生菌株，編號為LL03（Ascomycota子囊菌門）、LL16（Ascomycota子囊菌門）、MG17（Basidiomy?cota擔子菌綱）、MG27（Leotiomycetes錘舌菌綱），由上海派森諾生物科技股份有限公司鑒定［8］。供試外生菌株為美味牛肝菌（Boletusedulis）于市場購買。

供試杜鵑苗為一年生無菌扦插苗，基質為腐殖土+珍珠巖+黃壤（1：1：2）用高溫高壓法（121℃，0.1 MPa）滅菌120 min后備用，塑料花盆規(guī)格為上口徑（16 cm）×下口徑（11 cm）×高（14 cm）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培育及菌劑制備

首先是菌株活化，在PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基上對試驗所用的4個內生菌菌株進行活化，放入25℃人工氣候箱內暗培養(yǎng)；其次是擴繁，待其長滿菌絲后，再在PDA液體培養(yǎng)基上接種已活化的菌株進行擴繁；最后是菌劑備用，將上個步驟中的PDA液體培養(yǎng)基放于28℃搖床上振蕩并進行十五天的暗培養(yǎng)后，打碎制作成液體菌劑備用。同時將美味牛肝菌子實體Boletusedulis打成勻漿狀備用。

1.2.2 試驗設計

接菌設置3個接菌處理，分別為CK處理（接種無菌株液體培養(yǎng)基）、D處理（ERM菌株混合接菌）、DM處理（ECM+ERM菌株混合接菌）。用醫(yī)用注射器裝取10 ml菌劑施入杜鵑苗根系周圍土壤，于2018年7月20日第一次施入菌液，接著每隔7 d施入1次菌液，連續(xù)施入3次結束。

水分處理即輕度水濕W1（85%～95%）、正常水分W（75%～80%）、輕度干旱T1（60%～65%）、中度干旱T2（50%～45%）和重度干旱T3（35%～40%）。注：百分比為土壤含水量與田間最大持水量的比率。于2019年6月至7月進行水分脅迫實驗，每處理15盆，每盆1株，各處理重復3次，共675株苗。每天傍晚17點至18點通過稱重法（電子稱質感0.1 g）補充白天散失水分，讓土壤相對含水量保持相對穩(wěn)定，在處理30 d后對各項指標進行隨機取樣檢測。

1.3 指標測定

菌根侵染率測定采用醋酸墨水染色法［9］；采集不同處理杜鵑植株頂部向下第4、第5片成熟功能葉片進行混合取樣后，葉綠素采用熊慶娥方法測定［10］；光合特征參數(shù)利用CI-340手持式光合作用測定系統(tǒng)測定；葉綠素熒光動力學參數(shù)參照王好運測定方法測定［11］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和繪圖用WPS，統(tǒng)計分析用SPSS 21.0，各處理間的差異性采用單因素方差分析和Duncan多重比較法。

2 結果與分析

2.1 混合接菌處理杜鵑苗根系菌根侵染率

將菌株活化擴繁后，對一年生杜鵑苗進行接種處理，常規(guī)養(yǎng)護培育后進行侵染率測定。從圖1可見，不同混合菌劑接種處理對杜鵑幼苗根系侵染率呈顯著差異。CK處理侵染率為7.11%，D處理侵染率為32.3%，DM處理侵染率為51.2%，可見接種混合菌劑能成功侵染杜鵑根系，不同混合菌劑對杜鵑根系侵染程度不一樣。

圖1 接種不同混合菌劑杜鵑苗侵染率Fig.1 Mycorrhizal colonsation of different compound strains inoculation of R.simsii Planch

2.2 不同水分梯度下接種混合菌劑對杜鵑苗葉綠素含量的影響

由圖2～3可知，同一水分梯度下，D、DM處理葉綠素a、b含量均高于CK組，差異極顯著（P＜0.01），DM與D處理，無顯著差異差異（P＞0.05）。與正常供水相比，輕度水濕條件下，CK處理葉綠素a、b含量下降，D、DM處理葉綠素a、b含量則呈上升變化；隨著土壤水分含量降低的加劇，CK組葉綠素a、b含量逐步下降，在T3時最低；接菌處理與之相反，杜鵑葉片葉綠素a、b含量的變化趨勢為先上升后下降，在T2處理下葉綠素a、b含量最高。在水分脅迫下，接菌處理能顯著增加杜鵑葉片葉綠素a、b含量且適度干旱能提高葉片葉綠素含量。

圖2 不同水分梯度下杜鵑菌根苗葉片葉綠素a含量Fig.2 The chlorophyll a content of R.simsii Planch for inocula?tion treatment under different water gradients

從圖4～5可以看出，CK處理杜鵑葉片葉綠素總量在輕度水濕下呈下降變化，D、DM處理出現(xiàn)上升趨勢。隨著土壤水分的減少，CK處理杜鵑葉片葉綠素總含量逐漸降低，而D、DM處理則先升高后降低，在T2下達到最高。同一水分梯度下，DM、D處理杜鵑葉片葉綠素總含量均高于CK，差異極顯著（P＜0.01）。各水分梯度下杜鵑葉片葉綠素a/b比值CK處理均大于接菌處理，在W和W1條件下CK與D、DM處理差異極顯著（P＜0.01），在T1、T2和T3條件下差異顯著（P＜0.05），D、DM之間差異不顯著?？梢姡泳茉黾佣霹N葉綠素的積累，T2水分條件下接菌苗葉綠素含量最高。

圖3 不同水分梯度下杜鵑菌根苗葉片葉綠素b含量Fig.3 Thechlorophyll b content of R.simsii for inoculation treatment under different water gradients

圖4 不同水分梯度下杜鵑菌根苗葉片葉綠素a+b含量Fig.4 Thechlorophyll a+b content of R.simsii Planch for inoc?ulation treatment under different water gradients

圖5 不同水分梯度下杜鵑菌根苗葉片葉綠素a/b比值Fig.5 The chlorophyll a/b of R.simsii Planchfor inoculation treatment under different water gradients

2.3 不同水分梯度下接種混合菌劑對杜鵑苗光合特征參數(shù)的影響

從圖6可以看出，同一水分條件下，接種處理的杜鵑葉片凈光合速率均高于CK，差異極顯著（P＜0.01）。其中D、DM處理間在W、T2水分下差異不顯著（P＞0.05），在T1水分梯度下差異顯著（P＜0.05），在W1、T1處理下差異極顯著（P＜0.01）。與正常供水相比，T1水分下杜鵑葉片凈光合速率均呈下降變化；隨著土壤水分含量的降低，CK處理杜鵑葉片凈光合速率呈下降變化，在T3水分下達到最低；接菌處理呈先升高后下降變化，以DM處理在T2水分下杜鵑葉片Pn值最大，達1.33 mmol·m-2·s。

圖6 不同水分梯度下杜鵑菌根苗葉片凈光合速率Fig.6 The net Photosynthesis rate of R.simsii Planch for inoc?ulation treatment under different water gradients

從圖7可以看出，同一水分梯度下，各處理的杜鵑葉片氣孔導度值均為DM＞D＞CK，三者之間差異顯著。W1水分梯度下，杜鵑葉片氣孔導度出現(xiàn)輕微下降，降幅為CK（10.70%）＞D（8.51%）＞DM（1.3%）；隨著土壤水分含量的減少，各處理杜鵑葉片氣孔導度逐漸下降，其降幅依次為CK（51.04%）＞D（39.04%）＞DM（38.12%）。

圖7 不同水分梯度下杜鵑菌根苗葉片氣孔導度Fig.7 The stomatal conductancen of R.simsii Planch for inocu?lation treatment under different water gradients

從圖8可以看出，不同水分梯度下，接菌處理杜鵑葉片蒸騰速率均為DM＞D＞CK，且各處理間差異極顯著。杜鵑葉片蒸騰速率的變化與氣孔導度的變化趨于一致，即在W1水分處理下降低；在土壤水分缺失條件下，隨著干旱脅迫程度的加劇呈降低變化，降幅依次為CK（48.19%）＞D（31.20%）＞DM（22.15%）。

圖8 不同水分梯度下接種菌根真菌杜鵑蒸騰速率Fig.8 The transpiration rate of R.simsii Planch for inoculation treatment under different water gradients

從圖9可以看出，在各水分梯度下，CK杜鵑葉片胞間CO2濃度均為最高值，依次為437.7、439、459.57、477、488。W1水分條件下，CK、D、DM杜鵑葉片處理胞間CO2濃度與正常供水相比胞間CO2濃度均上升，CK及D處理差異極顯著，DM處理差異顯著。與正常供水相比，隨著土壤水分含量的降低，CK處理胞間CO2濃度呈上升趨勢，在T3水分下達到最大值；D、DM處理則先下降后升高，在T2水分下達到最低值；各接菌處理杜鵑葉片胞間CO2濃度均為CK＞D＞DM。

圖9 不同水分梯度下接種菌根苗葉片胞間CO2濃度Fig.9 Intercellular CO2 concentration in leaves of R.simsii Planch for inoculation treatment under different water gradients

2.4 不同水分梯度下接種混合菌劑對杜鵑苗葉綠素熒光參數(shù)的影響

由表1可知，在W水分條件下，接菌處理的杜鵑葉片F(xiàn)o、Fm值均大于CK處理，依次為DM＞D＞CK各處理間差異極顯著。相較于W水分處理，W1水分梯度下的Fm值均有所下降，CK處理杜鵑葉片F(xiàn)o值上升，D、DM處理呈下降變化。與W水分處理相比，隨著土壤水分含量的減少CK處理Fo值持續(xù)增長，在T3達到最高值234，D、DM處理則先下降，在T2水分下分別達到最低值176、186，后在T3水分下增加分別達到最高值213、236，增幅依次為CK（22.51%）＞D（4.92%）＞DM（3.06%）。

表1 不同水分梯度對杜鵑接菌苗葉綠素熒光參數(shù)的影響Table 1 Effects of different water gradients on chlorophyll fluorescence parameters of R.simsii Planch inoculated seedlings

同一水分條件下，接菌杜鵑苗Fv/Fm均高于CK，且差異極顯著。除W1水分下D處理Fv/Fm略大于DM處理外（差異不顯著，P＞0.05），其他水分條件下均為DM＞D＞CK。與W水分處理相比，W1水分條件下CK、D處理Fv/Fm輕微上升，而DM處理基本沒有變化。隨著干旱程度的加大CK處理Fv/Fm持續(xù)下降，而D、DM處理則先上升后下降，其降幅依次為CK（16.24%）＞D（7.48%）＞DM（5.68%）。由表1可知，除W1水分處理外，各處理Fv/Fo值為CK（3.61）＞D（3.43）＞DM（3.26）外，其余水分梯度下均為DM＞D＞CK。隨著土壤水分的減少，CK處理Fv/Fo持續(xù)下降，而D、DM處理先上升后下降。

同一水分條件下，各處理PSⅡ值均為DM＞D＞CK，差異極顯著。相較于W水分，在W1條件下，各處理PSⅡ均有不同程度的下降，降幅依次為CK（21.05%）＞D（14.29%）＞DM（6.52%）。隨著干旱脅迫的加劇，各處理PSⅡ均持續(xù)下降，降幅依次為CK（23.68%）＞D（21.43%）＞DM（19.57%）。相較于W水分條件，CK處理在輕度水濕及干旱條件下ETR值均呈下降趨勢；而D、DM處理呈上升的變化趨勢，并在干旱條件下則先上升后下降，在T2處理下達到最高值。

與W水分條件下相比，在W1水分梯度下，各處理qP值均下降，降幅為CK（13.56%）＞D（5.78%）＞DM（2.70%）。在干旱條件下，隨著脅迫的加重CK處理qP值持續(xù)下降，而D、DM處理先上升后下降。且在同一水分梯度下接菌處理qP值均大于CK處理，且均為DM＞D＞CK，差異極顯著（除T2水分下DM與D處理差異顯著外）。輕度水分條件下水分處理下CK處理NPQ呈上升趨勢，D、DM則出現(xiàn)不同幅度下降，D接菌處理降幅（18.18%）大于DM接菌處理降幅（15.83%）。隨著干旱程度的增加，各處理杜鵑葉片NPQ均出現(xiàn)不同程度的下降降幅為CK（57.84%）＞D（38.18%）＞DM（35.00%），且除W1水分條件下NPQ值大小CK＞DM＞D外，其余水分下均為DM＞D＞CK，差異極顯著。

相同水分梯度下，各處理杜鵑葉片ETRm、α數(shù)值均為DM＞D＞CK，差異極顯著。W1水分梯度下ETRm、α數(shù)值均下降，在土壤水分缺失條件下隨著干旱程度的加劇，3個處理的杜鵑葉片α數(shù)值持續(xù)下降，而ETRm的變化則為CK持續(xù)下降，D、DM先升高后下降，在T2水分下達到最大值。

3 結論與討論

植物進行光合作用能力可通過葉綠素含量變化來反映。本研究結果表明，接菌處理杜鵑葉片葉綠素a、b及a+b含量均高于CK，與諶端玉等人研究結果一致［4］。相較于W水分條件，在W1水分條件及土壤缺水條件下，CK處理杜鵑葉片葉綠素a、b及葉綠素總量呈下降變化，而D、DM處理則先升高后下降，在T2處理下達到最高值，這說明在適度缺水環(huán)境，菌根苗反而能合成更多的葉綠素來提高杜鵑苗的光合能力，這與何興元等人研究結果相似［12］。張明生等以甘薯為研究對象，得出植物抗旱性越強葉綠素a/b比值下降的程度越高［13］的結論。本研究表明各水分條件下，接菌處理的杜鵑葉片葉綠素a/b比值低于CK處理，且CK＞D＞DM，說明接菌苗的葉綠素b對水分變化比葉綠素a敏感，且接菌苗更能適應缺水環(huán)境，這與龍海燕等人的研究結果一致［14］。本研究結果表明，對杜鵑幼苗接種菌根真菌能明顯減輕干旱對杜鵑幼苗葉片葉綠素合成的抑制作用，其中DM處理的效果好于D處理，且以T2水分條件下最為明顯。

本研究結果表明，W1水分處理降低了杜鵑凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr），但接種菌根真菌能增強蒸騰速率來抵抗水濕脅迫的傷害，并且本研究亦證實接種菌根真菌可以提高杜鵑光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）。然而隨著脅迫程度的提高，菌處理杜鵑葉片Pn先升高在T2水分下達到最高值，后在T3處理下下降，而CK處理則持續(xù)下降，表明接菌處理在適度干旱條件下對杜鵑的作用更為重要，這與田帥等研究得出在水分脅迫時接種AMF可提高刺槐的光合作用水平的結論相似［15］。

葉綠素熒光參數(shù)是反應植物抗逆性的重要指標［16］，能更內在地反映水分脅迫對植物光系統(tǒng)Ⅱ的影響。在水分脅迫環(huán)境中，初始熒光（Fo）升高，植物葉片PSⅡ反應中心遭到破壞［17］。本研究中，W1水分處理下，CK處理Fo明顯升高，而接菌處理呈下降趨勢；W水分梯度下，接菌處理Fo大于CK處理，在T1、T2水分下，接菌處理Fo呈下降變化，在T3下上升，而CK一直呈上升趨勢。這說明在適度脅迫時，接菌處理對杜鵑PSⅡ反應中心具有一定保護作用。在水濕及缺水環(huán)境下各處理杜鵑葉片F(xiàn)m均呈下降趨勢，說明水分脅迫降低了杜鵑PSⅡ反應中心原初電子受體QA的還原能力，電子傳遞活性降低［18］。接菌處理Fm值顯著高于CK處理，且DM處理始終大于D處理，缺水環(huán)境下，DM處理Fm降幅最小，CK處理降幅最大，說明接菌能提升杜鵑葉片PSⅡ反應中心原初電子受體QA的還原能力，增加其水分脅迫環(huán)境的適應能力。

Fv/Fm和Fv/Fo也與植物葉片PSⅡ反應中心的活性密切相關［19］，當植物受到脅迫時，F(xiàn)v/Fm值呈降低變化［20］。本研究中，接菌處理Fv/Fm顯著高于CK處理，且在W1水分處理及干旱脅迫下CK處理杜鵑葉片F(xiàn)v/Fm下降，而接菌處理則先上升后下降，可能是因為適度土壤干旱環(huán)境下接菌處理能夠明顯使杜鵑PSⅡ反應中心潛在活力得到提高同時提升PSⅡ反應中心原初光能轉換效率。

本研究中，W1水分梯度下，各處理qP值下降，CK處理NPQ上升，而兩個接菌處理NPQ也呈下降變化。在土壤缺水環(huán)境下，CK處理中qP值持續(xù)下降，接菌處理則先上升后下降，三個處理中的NPQ則都下降，各水分下接菌處理NPQ顯著高于CK處理。這可能是由于水分環(huán)境脅迫壓力讓杜鵑光能用于光化學反應的部分減少，使于PSⅡ反應中心的光化學活性降低造成光能過剩，導致qP下降［21］。但接菌處理的杜鵑通過提高NPQ及時消耗掉過剩的光能來減緩脅迫環(huán)境對自身的傷害。同時，接菌苗最大電子傳遞速率（ETRmax）及光能利用效率（α）、均顯著高于CK處理，且接菌處理在T2水分處理下ETRm值達到最高，這可能是因為接菌苗會通過提高電子傳遞速率來響應能量過多耗散帶來的影響，增強其水分利用［19］。綜上所述，混合接菌能夠顯著提高杜鵑葉片葉綠素含量、光合參數(shù)以及葉綠素熒光參數(shù)，增強了杜鵑在水分脅迫下的光合作用。在水分脅迫環(huán)境下，接種DM相較于D和CK最能顯著提高杜鵑苗的光合能力，且以中度干旱下最為明顯。