李 濤，耿樹香，馬 婷，寧德魯，趙 鵬，余旭亞，韓本勇*

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省林業(yè)與草原科學(xué)院，云南 昆明 650201）

核桃（Walnut）又稱胡桃、羌桃，屬世界著名的四大干果之一［1］。我國核桃資源十分豐富，全國大多數(shù)省份都有栽種，栽種面積以及產(chǎn)量均居世界第一位［2］。核桃加工后的主要副產(chǎn)物-核桃殼，目前大多被拋棄或焚燒處理。研究表明，核桃殼中含有一定量的棕色素，是一種較為理想的天然色素資源，因此從核桃殼中提取棕色素既有利于廢棄物的回收利用又有益于環(huán)境保護。

目前對核桃殼棕色素的提?。?-6］有相關(guān)文獻報道，但對色素的純化及化學(xué)性質(zhì)等方面的研究報道較少。李維莉等［7］采用大孔樹脂對核桃殼棕色素進行純化，結(jié)果表明AB-8大孔樹脂對其有較高的吸附量，純化效果較優(yōu)。但由于粗提色素中含有大量的雜質(zhì)，化學(xué)穩(wěn)定性較差，限制了其應(yīng)用，因而需進行精制。本研究采用AB-8大孔樹脂對核桃殼棕色素進行純化，主要優(yōu)化了核桃殼棕色素動態(tài)純化的最佳工藝條件，并對純化后的核桃殼棕色素進行一系列的穩(wěn)定性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃殼棕色素粗品（自制）；AB-8大孔樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（貴州迪大科技有限責(zé)任公司）；福林酚試劑（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、沒食子酸、無水乙醇、95%乙醇、CuSO4、FeCl3、AlCl3、ZnSO4、MgSO4、H2O2、Na2SO3等試劑為分析純。

DHL-A電腦恒流泵、SBS-100自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠）；分光光度計（日本島津）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科儀器有限公司）；冷凍干燥機（美國SIM）；pH計（瑞士梅特勒-托利多）；數(shù)字照度計（臺灣泰仕）。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃殼棕色素的提取方法

將核桃殼粉碎，烘干后用石油醚進行脫脂處理，然后用1%氫氧化鈉溶液作為提取劑，超聲輔助提取60 min，提取結(jié)束后離心、過濾分離，將上清液用檸檬酸中和至pH 7.0，冷凍干燥即得核桃殼棕色素粗品。

1.2.2 核桃殼棕色素的光譜測定

取少量色素粗制品，用去離子水配制成色素溶液，用紫外可見分光光度計，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，得到其吸收光譜圖（見圖1），以確定最大吸收峰值時波長。

1.2.3 動態(tài)吸附與解吸實驗

吸附流速對樹脂吸附的影響：先對AB-8大孔樹脂，用95%乙醇進行浸泡24 h，濕法裝柱，用水洗至無醇味后，再用5%HCl溶液繼續(xù)浸泡4 h，水洗至中性后用5%NaOH溶液再浸泡4 h，水洗至中性后抽濾去水分，置于110℃烘箱中干燥6 h，自然冷卻后備用。將預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂裝柱，取一定量的稀釋色素液上柱，分別設(shè)置流速為0.5 mL/min、1.5 mL/min和2.5 mL/min，分步收集流出液并在波長277 nm下測定吸光度。當(dāng)流出液吸光度值為上柱前樣液吸光度值的1/10時，認為到達泄露點，分別以流出液體積和流出液吸光值/色素原液吸光值（A/A0）為橫、縱坐標(biāo)，繪制泄露曲線［8-9］。

上樣液濃度對樹脂吸附的影響：將預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂裝柱，分別配制濃度為1 mg/mL、2 mg/mL和3 mg/mL的色素溶液，將上樣流速設(shè)為1.5 mL/min，分步收集流出液，在波長277 nm下測定吸光度并繪制泄露曲線［10］。

洗脫流速對樹脂解吸的影響：取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹脂裝柱，向柱內(nèi)流加濃度為2 mg/ml的色素溶液，待吸附飽和后，用50%的乙醇溶液作為解吸液，設(shè)置解吸液流速分別為1.0 mL/min、1.5 mL/min和2.0 mL/min，分步收集流出液并測定吸光度。

1.2.4 色價、黃酮、多酚的測定

色價的測定：準(zhǔn)確稱取純化前后的核桃殼棕色素樣品各0.1 g，用100 mL去離子水溶解，在其最大吸收波長277 nm處測定吸光度，然后以公式E1%1cm=AR計算色價［7］，式中，A為樣品溶液吸光度，R為100 mL浸提液上機測試時的稀釋倍數(shù)。

黃酮含量測定：以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法分別測定純化前后色素樣品中的黃酮含量［11］。

多酚含量測定：總酚含量的測定采用Folin酚法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后分別測定純化前后色素樣品中的多酚含量［12］。

1.2.5 核桃殼棕色素的穩(wěn)定性研究

（1）溫度對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

取適量純化后的核桃殼色素制品，配制成0.01%的溶液，分別置于不同溫度（25、40、60、80、100℃）保溫4.0 h，每隔1.0 h取1次樣，冷卻后在277 nm處測定其吸光度［13］。

（2）光照對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

取適量純化后的核桃殼色素配制成0.01%的溶液，分別置于模擬的室內(nèi)暗室（0 lux）、室內(nèi)自然光（350 lux）和室外自然光（7500 lux）8.0 h，每隔1.0 h取1次樣，在277 nm處測其吸光度［14］。

（3）pH值對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

取適量純化后的核桃殼色素配制成0.01%的溶液，用磷酸二氫鈉-檸檬酸和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 配 置pH 3.0，pH 4.0，pH 5.0，pH 6.0，pH 7.0，pH 8.0，pH 9.0，pH 10.0的緩沖液，備用。分別量取2.0 mL色素溶液與8.0 mL不同pH值緩沖液混合均勻后，于277 nm處測定其吸光度，并觀察顏色變化［15］。

（4）金屬離子對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

分別配制濃度為0.05 mol/L的NaCl、KCl、CaCl2、CuSO4、MgSO4、AlCl3、FeCl3、ZnCl2溶液，各取2 mL溶液，向其中加入8 mL 0.01%的色素溶液，以2.0 mL去離子水加8.0 mL色素溶液作為對照品。室溫放置24 h后觀察顏色變化并在277 nm處測定其吸光度［16］。

（5）氧化還原劑對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

配制濃度為0.1%、1%、2%和5%的H2O2、Na2SO3溶液，分別吸取不同濃度的H2O2、Na2SO3溶液2.0 mL，各加入8.0 mL 0.01%的色素溶液，以2.0 mL去離子水加8.0 mL色素溶液作為對照品。室溫放置1 h后觀察顏色變化并在277 nm處測定其吸光度［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗方法

由圖1可見，核桃殼棕色素溶液最大吸光度在277 nm處。

圖1 核桃殼棕色素的全波長掃描圖Fig.1 Full wavelength scan of walnut shell brown

2.2 動態(tài)吸附與解吸試驗結(jié)果

2.2.1 吸附流速對大孔樹脂吸附的影響

由圖2可以看出，當(dāng)上樣液流速增加，泄露點提前?？赡艿脑蛟谟诹魉龠^快，色素溶液還未能夠與大孔樹脂內(nèi)表面充分接觸就流出；而當(dāng)吸附流速降低時，樹脂的吸附效率有較大提升，但這過于耗費時間。因此，本實驗中選取上樣液吸附流速為1.5 mL/min。

圖2 吸附流速對樹脂吸附的影響Fig.2 The influence of flow rate on ability of adsorption by macroporous resin

2.2.2 上樣液濃度對大孔樹脂吸附的影響

由圖3可以看出，隨著色素溶液濃度的增大，泄漏點出現(xiàn)的越早。此時，色素溶液濃度過低，色素不易被樹脂吸附；而溶液濃度過高，則又會導(dǎo)致其中的雜質(zhì)也被樹脂吸附，因而不利于對色素的吸附，且對后續(xù)的洗脫等操作也不利。因此核桃殼棕色素上樣液的濃度選取2 mg/mL較為合適。

圖3 上樣液濃度對樹脂吸附的影響Fig.3 The influenceof concentration on ability of adsorption by macroporous resin

2.2.3 洗脫流速對解吸效果的影響

從圖4可以看出，當(dāng)提升洗脫流速后，峰形變寬，洗脫不完全，而當(dāng)流速為1 mL/min時，不但峰值最高，且沒有拖尾現(xiàn)象，因此為了確保解吸效果，選取洗脫流速為1 mL/min進行解吸。

圖4 洗脫流速對解吸的影響Fig.4 The influence of eluent rate on desorption property

2.3 色價、黃酮、多酚的測定結(jié)果

色價是評定天然色素的重要指標(biāo)之一，它能夠在一定程度上反映色素含量的高低及其著色能力的強弱。核桃殼中含有一定量的黃酮和多酚類物質(zhì)，而這些也是天然色素的組成成分［17］。由表1可以看出，純化后色素的色價是純化前的3.58倍，黃酮和多酚含量分別是純化前的1.34倍和1.59倍，表明純化取得較好效果。

表1 純化前后色價及黃酮、多酚含量變化Table 1 The color value，flavonoids and polyphenols content changes before and after the purification

2.4 核桃殼棕色素穩(wěn)定性

2.4.1 溫度對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，在時間相同的條件下，當(dāng)溫度小于80℃時，色素溶液的吸光度隨著溫度的上升變化不大；當(dāng)溫度大于80℃時，色素溶液的吸光度隨著溫度的升高而增加。有文獻曾報道高溫或長時間加熱會對色素造成較強的破壞［7］，由于色素遭到破壞，導(dǎo)致在原特征峰下其吸光度值有所上升。綜上說明核桃殼棕色素具有一定的耐熱性。

圖5 溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of pigment

2.4.2 光照對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，核桃殼色素溶液在室內(nèi)自然光、室外自然光和暗室環(huán)境中放置一段時間后吸光度都有所減小，經(jīng)室外自然光處理后的吸光度值變化較室外自然光和暗室處理的變化明顯。這說明日光照射促進了色素的降解，這可能是由于光線誘使組成天然色素的活性有機物分解或氧化而褪色［18］，因此使用中應(yīng)盡量避免在強光下長時間照射。

圖6 光照對色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of light on the stability of pigment

2.4.3 pH值對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

由圖7可知，在酸性（pH＜7）條件下，溶液的吸光度沒有顯著變化，而在pH超過8以后，隨著堿性的增強，溶液的吸光度逐漸上升，而且溶液顏色略有加深。這可能是由于棕色素內(nèi)含有黃酮類物質(zhì)［19］，而黃酮類化合物在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性環(huán)境下其環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生查爾酮類物質(zhì)，使溶液顏色加深［20］。由于色素成分遭到破壞，導(dǎo)致在原特征峰下其吸光度值有所上升。

圖7 不同pH值對色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH value on the stability of pigment

2.4.4 金屬離子對桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

由表2以看出，多數(shù)金屬離子對色素?zé)o太大影響，但Cu2+、Al3+、Fe3+、Zn2+等離子能使色素顏色發(fā)生改變，同時有沉淀析出，可能這些離子與核桃殼棕色素形成絡(luò)合物所致。對照品的吸光度值為0.765，從對應(yīng)的吸光度也可以看出Cu2+、Al3+、Fe3+、Zn2+等離子對色素有破壞作用，因此在使用過程中應(yīng)盡量避免與這些金屬離子接觸。

表2 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of metal ions on the stability of pigment

2.4.5 氧化還原劑對核桃殼棕色素穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，色素溶液的吸光度隨著H2O2濃度的增大而顯著上升，表明氧化劑對色素的破壞作用很大，在實際的應(yīng)用中應(yīng)避開與氧化劑直接接觸，以免影響產(chǎn)品的質(zhì)量；而隨著Na2SO3濃度的增大只有略微增加，表明還原劑對色素的影響較小。

圖8 氧化劑和還原劑對色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of oxidant and reducer on the stability of pigment

3 結(jié)論

（1）AB-8大孔樹脂對核桃殼棕色素動態(tài)純化的最佳工藝條件為：色素上樣流速1.5 mL/min，上樣液濃度為2.0 mg/mL，洗脫劑洗脫流速1.0 mL/min。

（2）純化后色素的色價是純化前的3.58倍，黃酮和多酚含量分別是純化前的1.34倍和1.59倍，表明大孔樹脂對核桃殼棕色素的純化有較好效果。

（3）據(jù)穩(wěn)定性試驗分析，純化后的核桃殼棕色素耐熱性較好，在酸性以及中性條件下均比較穩(wěn)定，室外光照、氧化劑和Cu2+、Al3+、Fe3+、Zn2+對其有一定影響。