丁朝陽, 趙 樂, 劉 蘇, 李茂業(yè)

(安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室, 合肥230036)

熱激蛋白(heat shock proteins, HSPs)又稱熱休克蛋白，是普遍存在于原核與真核生物的一類分子伴侶，其主要功能是幫助細胞內(nèi)其他新生肽鏈正確折疊、減少肽鏈非正常聚集，以及幫助錯誤折疊的肽鏈降解(Feder and Hofmann, 1999)。生物體在外界不利環(huán)境因子(如低溫、高溫和紫外線輻射等)的脅迫下，蛋白功能受損，細胞穩(wěn)態(tài)被破壞，此時HSPs大量表達，幫助生物體抵御外界脅迫，從而增強生物體的抗逆能力(S?rensenetal., 2003)。根據(jù)HSPs的分子量大小，可將其劃分為4個家族：HSP90, HSP70, HSP60和小分子量HSP(King and MacRae, 2015)。其中HSP70家族又包括誘導型HSP70和組成型HSC70。誘導型HSP70在正常情況下表達量較低，但受到外界因子脅迫后其表達量迅速增加；而組成型HSC70在外界因子脅迫下表達量變化不顯著(Moreira-de-Sousaetal., 2018)。

昆蟲同樣表達多個家族的HSPs(王海鴻和雷仲仁, 2005)。其中HSP70家族是最為保守的一類，該家族因為在昆蟲抵御外界脅迫中的重要功能而受到廣泛關注(King and MacRae, 2015)。如煙粉虱Bemisiatabaci受到高溫脅迫后，1個HSP70基因表達量迅速上調(diào)，而利用RNA干擾技術沉默該基因后，試蟲在高溫脅迫下的死亡率顯著升高(Wangetal., 2019)。又如大量失水使埃及伊蚊Aedesaegypti的1個HSP70基因的表達水平大幅提升，而沉默該基因后，試蟲對失水脅迫的耐受性顯著降低(Benoitetal., 2010)。此外，當昆蟲遭受紫外線、殺蟲劑、重金屬、病原物以及天敵寄生等脅迫時，HSP70基因的表達量均迅速增加，以增強昆蟲對這些脅迫因子的抵御能力(Chenetal., 2012; Huetal., 2019; 楊昌利等, 2019; Zhouetal., 2020)。還有一些研究表明，昆蟲HSP70基因的表達受保幼激素調(diào)控，并參與昆蟲的生殖與發(fā)育過程(Guetal., 2012; Luoetal., 2017)。

菜粉蝶Pierisrapae屬鱗翅目(Lepidoptera)粉蝶科(Pieridae)，是為害十字花科作物的重要害蟲。菜粉蝶幼蟲取食葉片，嚴重時葉片只剩葉脈和葉柄；幼蟲排泄物能引起作物軟腐病，嚴重影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量(蔣杰賢等, 2002)。施用化學殺蟲劑仍是目前控制菜粉蝶為害的有效措施，高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺是當前常用的兩種藥劑(王品舒等, 2017)。在其他昆蟲中雖有一些研究表明HSP70在抵御殺蟲劑脅迫中起作用，但菜粉蝶的HSP70是否參與對殺蟲劑脅迫的響應，目前仍然未知。本研究鑒定了菜粉蝶3個HSP70基因，分析了它們所編碼蛋白的分子特征，并檢測了這些基因在不同發(fā)育階段、不同組織以及在高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺脅迫下的表達譜，以期為進一步研究HSP70在菜粉蝶抵御殺蟲劑脅迫中的功能和作用機制提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試菜粉蝶為本實驗室飼養(yǎng)種群(Liuetal., 2017)。幼蟲使用甘藍葉片飼養(yǎng)，成蟲飼喂10%(v/v)蜂蜜水，飼養(yǎng)溫度為25±1℃，相對濕度為70%±5%，光周期為16L∶8D。收集2-5齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲，其中2齡幼蟲收集30頭，其余齡期幼蟲、蛹和成蟲均為15頭，分別為一個生物學重復。取4齡幼蟲30頭為一個生物學重復，在冰上解剖中腸、馬氏管、脂肪體和體壁。各蟲齡試蟲和組織解剖試蟲取樣均設置3次生物學重復。所有樣品均用液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 殺蟲劑處理

高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺原藥購自德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度均大于95%。將兩種殺蟲劑分別溶于丙酮，并分別稀釋至0.12和1.04 ng/μL。采用點滴法，將2種藥劑分別點滴至菜粉蝶4齡幼蟲腹部背板上，每頭幼蟲點滴1 μL。所用劑量均為這2種殺蟲劑的LD20劑量(Liuetal., 2017)。對照組試蟲點滴等量的丙酮。分別于處理后0, 6, 12, 18和24 h收集存活的試蟲，液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱。實驗設3次生物學重復，每個生物學重復包含30頭試蟲。

1.3 RNA提取和cDNA第1鏈合成

使用RNAiso Plus試劑(寶生物，大連)提取樣本的總RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo Scientific，美國)檢測RNA的完整性和濃度。利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉錄試劑盒(東洋紡，日本)合成cDNA第1鏈。

1.4 菜粉蝶HSP70基因鑒定與序列分析

以小菜蛾Plutellaxylostella的HSP70氨基酸序列為模板(夏曉峰等, 2013)，使用BioEdit軟件中的BLAST程序(TBLASTN算法，e-value=1×105)，在菜粉蝶轉錄組unigene庫(Qietal., 2016)中進行同源檢索，獲得菜粉蝶HSP70基因的cDNA序列。這些基因所編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點使用ExPASy在線工具計算(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)，亞細胞定位使用CELLO程序預測(http:∥cello.life.nctu.edu.tw/)。下載菜粉蝶全基因組DNA序列(Shenetal., 2016)，使用Splign程序分析菜粉蝶HSP70基因在基因組框架(scaffold)上的位置及其外顯子和內(nèi)含子結構(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi)。多序列聯(lián)配使用Clustal Omega程序進行(http:∥www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)，聯(lián)配結果導入MEGA7.0軟件，使用最大似然法(maximum likelihood)構建系統(tǒng)進化樹(Kumaretal., 2016)。各分支置信度經(jīng)Bootstrap法循環(huán)檢驗1 000次。

1.5 基因表達譜分析

使用實時熒光定量PCR檢測菜粉蝶HSP70基因的表達譜。所用引物列于表1，使用菜粉蝶18S rRNA和β-actin基因作為雙內(nèi)參基因(Liuetal., 2017)。在預實驗中，先利用反轉錄PCR和瓊脂糖凝膠電泳確認這些引物的擴增產(chǎn)物均為單一條帶，再將條帶回收，送生物公司測序，確認擴增產(chǎn)物是目標片段。同時以不同濃度的cDNA第1鏈為模板進行擴增，以Ct值為縱坐標，模板濃度對數(shù)值為橫坐標，進行直線擬合，根據(jù)直線的斜率計算引物擴增效率(表1)。

熒光定量PCR所用試劑為SYBR Green Real-time PCR Master Mix(東洋紡，日本)，反應總體系(20 μL): SYBR Green Mix 10 μL, cDNA第1鏈模板(10 ng)1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,無核酸酶的水8 μL。所用儀器為Bio-Rad公司CFX96型實時熒光定量PCR儀，熱循環(huán)參數(shù): 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 25 s, 40個循環(huán)。熱循環(huán)步驟結束后，溫度從60℃逐步上升至95℃，記錄熔解曲線，以檢測是否存在引物二聚體和非特異性擴增。同時在每一輪反應中均設置無核酸酶的對照和無cDNA模板的對照，以檢測反應液中是否存在污染。試驗設置3次生物學重復，每個生物學重復中包含4次技術重復，使用相對定量法計算基因表達量(Pfaffl, 2001)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)v9.5版(Tang and Zhang, 2013)進行，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)結合Tukey氏多重比較法分析多個樣本之間的顯著性差異，顯著性水平設為P<0.05。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結果

2.1 菜粉蝶HSP70基因序列分析

通過檢索菜粉蝶轉錄組，獲得了3個HSP70基因的cDNA序列，分別命名為PrHsp70-1,PrHsp70-2和PrHsp70-3(GenBank登錄號分別為MW691114, MW691115和MW691116)。這3個PrHsp70基因編碼的PrHSP70蛋白長度分別為628, 630和653個氨基酸，分子量分別為68.7, 69.2和71.7 kD。亞細胞定位預測結果表明，這3個PrHSP70蛋白均位于細胞質(zhì)內(nèi)。BLASTX最佳匹配結果表明，PrHSP70-1和PrHSP70-2分別與慶網(wǎng)蛺蝶Melitaeacinxia的HSP70-3(GenBank登錄號: AGR84218)和HSP70-2(GenBank登錄號: AGR84224)的氨基酸一致性最高，分別為85%和91%；而PrHSP70-3與小菜蛾HSC70(GenBank登錄號: BAE48743)的氨基酸一致性最高，為92%。

多序列聯(lián)配結果表明，3個PrHSP70蛋白中均含有HSP70家族的3個特征序列，前2個特征序列分別為IDLGTTYS和IFDLGGGTFDVSIL，第3個特征序列在PrHSP70-1和PrHSP70-2中為I/VVM/LVGGSTRIPKIQN/S，而在PrHSP70-3中為IVLVGGSTRIPRVQK(圖1)。此外，3個PrHSP70蛋白羧基末端的4個氨基酸殘基均為EEVD(圖1)。

3個PrHsp70基因位于不同的基因組框架(scaffold)上，其中PrHsp70-1位于scaffold_7，而PrHsp70-2和PrHsp70-3分別位于scaffold_109和scaffold_95(圖2)。PrHsp70-1和PrHsp70-2僅有1個外顯子，無內(nèi)含子，而PrHsp70-3在2個外顯子之間有一段346 bp的內(nèi)含子(圖2)。

2.2 HSP70基因系統(tǒng)進化

基于不同種類昆蟲的HSP70蛋白序列構建了系統(tǒng)進化樹(圖3)。從圖中可見，昆蟲HSP70被分為3個主要類群：胞質(zhì)HSP70、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)HSP70和線粒體HSP70。本研究鑒定的3個菜粉蝶PrHSP70均被劃分至胞質(zhì)HSP70類群，且被聚類至不同的進化分支中(圖3)。菜粉蝶PrHSP70-1與慶網(wǎng)蛺蝶的McHSP70(GenBank登錄號: AGR84218)親緣關系最近，而PrHSP70-2所在的進化分支中有多個鱗翅目HSP70，如家蠶Bombyxmori的BmHSP70(GenBank登錄號: NP_001296526)、斜紋夜蛾Spodopteralitura的SlHSP70(GenBank登錄號: XP_022834808)和煙草天蛾Manducasexta的MsHSP70(GenBank登錄號: XP_030032651)等。PrHSP70-3則與小菜蛾PxHSC70(GenBank登錄號: BAE48743)和二化螟CsHSC70(GenBank登錄號: BAE44308)處于同一進化分支(圖3)。

圖1 菜粉蝶PrHSP70氨基酸序列聯(lián)配Fig. 1 Alignment of amino acid sequences of PrHSP70s of Pieris rapae3個HSP70特征序列和羧基末端的EEVE基序以方框標示。Three HSP70 signature motifs and the C-terminal EEVE motif are boxed.

圖2 菜粉蝶PrHsp70基因的外顯子和內(nèi)含子結構Fig. 2 Exon-intron structure of PrHsp70 genes of Pieris rapae

圖3 基于氨基酸序列的昆蟲HSP70系統(tǒng)進化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of insect HSP70s based on amino acid sequence蛋白來源物種名縮寫Origin species abbreviation of proteins: Pr: 菜粉蝶Pieris rapae; Cs: 二化螟Chilo suppressalis; Px: 小菜蛾Plutella xylostella; Mc: 慶網(wǎng)蛺蝶Melitaea cinxia; Cf: 云杉卷葉蛾Choristoneura fumiferana; Bm: 家蠶Bombyx mori; Ms: 煙草天蛾Manduca sexta; Ha: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera; Sl: 斜紋夜蛾Spodoptera litura; Tc: 赤擬谷盜Tribolium castaneum; Ld: 馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata; Dp: 山松大小蠹Dendroctonus ponderosae; Lo: 稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus; So: 米象Sitophilus oryzae; At: 小蜂甲Aethina tumida; Fo: 西花薊馬Frankliniella occidentalis; Nl: 褐飛虱Nilaparvata lugens; Dm: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster; Aa: 埃及伊蚊Aedes aegypti. 括號中為GenBank登錄號; 3個PrHSP70蛋白以黑色圓圈標注。GenBank accession numbers are shown in parentheses. Three PrHSP70s are indicated by solid circles.

2.3 PrHsp70基因在不同發(fā)育階段和不同組織的表達模式

實時熒光定量PCR結果表明，PrHsp70-1和PrHsp70-2基因具有相似的表達模式，即在低齡幼蟲期表達量最低，在5齡幼蟲期表達量最高，但在蛹期和成蟲期表達量又顯著降低(P<0.05)(圖4: A, B)；PrHsp70-3在供試的不同發(fā)育階段樣本中的表達量差異不顯著(P>0.05)(圖4: C)。PrHsp70基因在4齡幼蟲不同組織中的表達模式不同，PrHsp70-1在脂肪體中的表達水平最高，且顯著高于在其他組織中的(P<0.05)(圖4: D)，PrHsp70-2在中腸中的表達水平最高(圖4: E)，PrHsp70-3在體壁和脂肪體中的表達量均最高(圖4: F)。

圖4 菜粉蝶PrHsp70基因在不同發(fā)育階段(A-C)和4齡幼蟲不同組織(D-F)中的表達譜Fig. 4 Expression profiles of PrHsp70 genes in Pieris rapae at different developmental stages (A-C)and in different tissues of the 4th instar larvae (D-F)A, D: PrHsp70-1; B, E: PrHsp70-2; C, F: PrHsp70-3. 2nd: 2齡幼蟲2nd instar larva; 3rd: 3齡幼蟲3rd instar larva; 4th: 4齡幼蟲4th instar larva; 5th: 5齡幼蟲5th instar larva; P: 蛹Pupa; fA: 雌成蟲Female adult; mA: 雄成蟲Male adult; MG: 中腸Midgut; MT: 馬氏管Malpighian tubules; FB: 脂肪體Fat body; IN: 體壁Integument. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同小寫字母表示基因表達量差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析和Tukey氏多重比較法)。Data in the figure are mean±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the gene expression level (P<0.05, one-way ANOVA and Tukey’s test). 圖5同The same for Fig. 5.

2.4 PrHsp70基因在LD20劑量殺蟲劑脅迫下的表達模式

LD20劑量高效氯氟氰菊酯處理4齡幼蟲后，PrHsp70-2響應最迅速，處理6 h后其表達量即顯著高于丙酮處理的對照組(P<0.05)(圖5: B)，而PrHsp70-1和PrHsp70-3對高效氯氟氰菊酯的響應較遲緩，在處理12 h后才開始上調(diào)(圖5: A, C)。PrHsp70-1在高效氯氟氰菊酯處理18 h后達到最大表達量，但在24 h時下調(diào)至正常水平,與對照組無顯著差異(P>0.05)(圖5: A)。PrHsp70-2在18 h時的表達量最高，在24 h時雖然下調(diào)，但仍顯著高于對照組(圖5: B)。PrHsp70-3在處理18 h后開始下調(diào)，處理24 h后其表達量顯著低于對照組(P<0.05)(圖5: C)。

LD20劑量氯蟲苯甲酰胺處理4齡幼蟲后，PrHsp70-1和PrHsp70-2的表達水平在4個時間段(6, 12, 18和24 h)均顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5: D, E)。其中PrHsp70-1表達量在處理12 h后達到最大值(圖5: D)，而PrHsp70-2表達量在處理18 h后達到最大值(圖5: E)。PrHsp70-3的表達量在處理6 h后顯著上調(diào)，處理12 h和18 h后雖有下降，但仍顯著高于對照組；該基因在處理24 h后恢復正常表達水平,與對照組無顯著差異(P>0.05)(圖5: F)。

圖5 菜粉蝶4齡幼蟲PrHsp70基因在LD20劑量的高效氯氟氰菊酯(A-C)和氯蟲苯甲酰胺(D-F)脅迫下的表達譜Fig. 5 Expression profiles of PrHsp70 genes in the 4th instar larvae of Pieris rapae exposed toLD20 of lambda-cyhalothrin (A-C) and chlorantraniliprole (D-F)A, D: PrHsp70-1; B, E: PrHsp70-2; C, F: PrHsp70-3.對照組試蟲點滴等體積丙酮。The test insects in the control group were dipped with equal volume of acetone.

3 討論

本研究鑒定了菜粉蝶3個PrHsp70基因。這3個基因編碼的PrHSP70蛋白的分子量均為70 kD左右，均與其他昆蟲中注釋的HSP70蛋白具有極高的氨基酸一致性，并且這3個PrHSP70蛋白均具有HSP70家族的3個特征序列(圖1)，表明它們屬于HSP70家族成員(譚瑤等, 2017; 楊昌利等, 2019)。HSP70家族包含誘導型HSP70和組成型HSC70，Sonoda等(2006)和Zhang等(2015)分析了鱗翅目代表性昆蟲二化螟和小菜蛾的HSP70和HSC70序列，認為“IVLVGGSTRIPKVQK”可能是鱗翅目HSC70的代表性特征。但本研究鑒定的3個PrHSP70蛋白均不具備該特征，因此這3個PrHSP70蛋白之中是否存在HSC70，尚需進一步研究。此外，3個PrHSP70蛋白羧基末端的4個氨基酸殘基均為EEVD，此基序是熱激蛋白的胞質(zhì)定位信號，推測3個PrHSP70蛋白均位于胞質(zhì)內(nèi)(Rosenzweigetal., 2019)，這一推論也與亞細胞定位預測和系統(tǒng)進化分析結果相符。PrHsp70基因序列的成功獲得為后續(xù)研究這些基因在菜粉蝶生長發(fā)育及脅迫響應中的功能奠定了基礎。

研究PrHsp70基因在菜粉蝶不同發(fā)育階段和幼蟲組織的表達模式，對于基因功能的預測有重要意義。本實驗發(fā)現(xiàn)在供試的菜粉蝶不同發(fā)育階段和幼蟲組織樣本中均能檢測到PrHsp70基因的表達，表明這3個基因編碼的蛋白廣泛參與菜粉蝶不同發(fā)育階段的生理活動中。在不同發(fā)育階段菜粉蝶中，PrHsp70-1和PrHsp70-2的表達水平均隨著幼蟲齡期的增加而增加，但在蛹期和成蟲期顯著下降(圖4: A, B)，表明這2個基因在幼蟲生長發(fā)育中起重要作用。相對于蛹期和成蟲期，幼蟲期的昆蟲更容易遭受外界不利因子的脅迫(王澤華等, 2014; Stejskaletal., 2021)，因而高量表達的PrHsp70基因可能也反映了幼蟲期菜粉蝶受到的環(huán)境壓力。本研究同時發(fā)現(xiàn)，PrHsp70-1在脂肪體的表達水平最高(圖4: D)，PrHsp70-2在中腸的表達水平最高(圖4: E)。脂肪體是昆蟲重要的新陳代謝器官，其較高的氧化水平可能會導致細胞壓力增大(Lietal., 2019)；中腸是昆蟲重要的消化器官，中腸細胞需要應對食物中的植物次生化合物以及食物表面的環(huán)境污染物和病原微生物等(Terraetal., 2019)，因此這些器官需要PrHSP70來保護并維持細胞的正常功能。在其他昆蟲中，也發(fā)現(xiàn)很多在脂肪體和中腸大量表達的HSP70基因(夏曉峰等, 2013; 孫猛等, 2014)。PrHsp70-3既大量表達于脂肪體，也大量表達于體壁(圖4: F)。昆蟲體壁是內(nèi)部器官與外界環(huán)境之間的屏障，外界不利環(huán)境因子直接作用于體壁之上(劉曉健等, 2019)。因此PrHsp70-3在體壁大量表達可能會提高菜粉蝶對逆境的耐受性。

對于昆蟲來說，殺蟲劑是最為重要的一類非生物脅迫因素。HSP70基因在昆蟲抵御殺蟲劑脅迫中的作用已有一些報道，如在褐飛虱Nilaparvatalugens中，吡蟲啉脅迫顯著增加了1個HSP70基因的表達水平，而沉默該基因后，試蟲對吡蟲啉的敏感性顯著上升(Luetal., 2017)；在亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis中，HSP70蛋白能夠結合蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白，增強害蟲的抗性(Shabbiretal., 2020)。 此外，當西花薊馬Frankliniellaoccidentalis、蘋果蠹蛾Cydiapomonella和灰飛虱Sogatellafurcifera等昆蟲受到阿維菌素、啶蟲脒、噻蟲嗪等殺蟲劑脅迫后，HSP70基因表達水平均顯著上調(diào)(Wangetal., 2014; Yangetal., 2016; Zhouetal., 2020)。本研究發(fā)現(xiàn)LD20劑量高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺處理能夠誘導3個PrHsp70基因不同程度上調(diào)表達(圖5)，它們的功能可能是在細胞內(nèi)合成更多的PrHSP70蛋白，進而通過修復殺蟲劑脅迫導致的細胞損傷，增強菜粉蝶對殺蟲劑脅迫的抵御能力。另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)LD20劑量高效氯氟氰菊酯處理24 h后，PrHsp70-3顯著下調(diào)表達(圖5: C)。外界脅迫誘導HSP70基因下調(diào)的現(xiàn)象在云杉卷葉蛾Choristoneurafumiferana和灰飛虱等昆蟲中也存在(Quanetal., 2020; Zhouetal., 2020)，這可能是昆蟲應對殺蟲劑脅迫的一種生理應激機制，因為HSP70蛋白行使功能需要消耗腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)，HSP70基因下調(diào)表達可以維持細胞內(nèi)ATP合成與消耗之間的平衡(Quanetal., 2020)。

需要指出的是，本研究只探討了菜粉蝶PrHsp70基因對殺蟲劑脅迫的響應，未研究這些基因在溫度脅迫下的表達模式。明確PrHsp70基因對溫度脅迫的響應可以更好地區(qū)分誘導型和組成型HSP70家族成員，并有助于更好地理解該基因家族在抵御外界脅迫中的作用。此外，本研究只從基因表達層面分析了PrHsp70基因與殺蟲劑脅迫之間的關系，未研究這些基因所編碼的蛋白質(zhì)在這一過程中的作用。在后續(xù)實驗中，我們將利用蛋白異源表達和RNA干擾等技術，深入探討PrHsp70基因響應殺蟲劑及其他環(huán)境脅迫因子的生理與分子機制。