魯盛平, 劉惠惠, 蘇治平, 劉倩霞, 侯有明, 石章紅,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué), 閩臺作物有害生物防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002; 2. 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002; 3. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福建省昆蟲生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002)

現(xiàn)有證據(jù)表明，昆蟲體內(nèi)的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)可以識別入侵微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，并在昆蟲免疫反應(yīng)的激活中扮演關(guān)鍵角色(Iwanagaetal., 2005; Zhanetal., 2016; Dawadietal., 2018)。在無脊椎動物中，已經(jīng)鑒定到的PRRs包括以下6個家族：C-型凝集素(C-type lectins, CTLs)、肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)、革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)合蛋白(Gram-negative bacteria-binding proteins, GNBPs)、含硫脂蛋白(thioester-containing proteins, TEPs)、Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和半乳糖苷結(jié)合凝集素(galactoside-binding lectins, GALEs)(Medzhitov and Janeway, 2002; 邢建曉等, 2016; 余靜等, 2017)。C-型凝集素(CTLs)是一類重要的模式識別受體，通過識別病原表面的糖配體廣泛參與介導(dǎo)昆蟲的體液免疫和細(xì)胞免疫(Brownetal., 2018； Dawadietal., 2018)。例如，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的DmCTL1能特異識別革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌Escherichiacoli，在Ca2+存在時，可以與大腸桿菌發(fā)生凝集反應(yīng)(Tanjietal., 2006)。重組表達(dá)的IML2可以激活酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)煙草天蛾Manducasexta對寄生蜂卵的包囊和黑化反應(yīng)(Yu and Kanost, 2000)。家蠶Bombyxmori的BmMBP屬于“immulectin”型成員，對革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌都具有凝集活性(Zhanetal., 2006)。

紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus是我國的一種林業(yè)外來入侵害蟲，嚴(yán)重危害棕櫚科經(jīng)濟(jì)植物和甘蔗等農(nóng)作物，并已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，該害蟲已被列為我國境內(nèi)的一種高風(fēng)險檢疫性有害生物(鞠瑞亭等, 2006; Shietal., 2014)。除交配和產(chǎn)卵外，該害蟲通常隱藏在棕櫚植物的樹干內(nèi)生活。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，該害蟲的危害癥狀十分隱蔽、通常很難被發(fā)現(xiàn)，從而造成巨大的防治困難(Shietal., 2014)。目前，化學(xué)防治是針對該害蟲的主要應(yīng)急防控措施。然而，現(xiàn)有證據(jù)表明該害蟲已對多種農(nóng)藥產(chǎn)生較強(qiáng)的抗藥性(Liuetal., 2021)。因此，發(fā)展基于信息素的誘捕技術(shù)和生物防治的綠色防控方案對該害蟲的持續(xù)管理具有重要的實(shí)踐意義(El-Suftyetal., 2007; Poorjavadetal., 2009)。已有研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌Beauveriabassiana和粘質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens對紅棕象甲幼蟲有較好的殺蟲活性(Dembilioetal., 2010; Puetal., 2017; Muhammadetal., 2019)。然而，紅棕象甲如何抵御這些病原生物侵染的機(jī)理尚不清楚。因此，本研究綜合運(yùn)用生物信息學(xué)、RT-qPCR、細(xì)菌注射感染和RNAi等方法分析了紅棕象甲C-型凝集素基因RfCTL-S1的序列特征、組織表達(dá)譜及其被沉默后對紅棕象甲幼蟲腸道和脂肪體中的抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)表達(dá)水平以及對其清除感染細(xì)菌能力的影響。本研究揭示了紅棕象甲C-型凝集素在該害蟲免疫防御中的作用角色，為生產(chǎn)實(shí)踐中提升病原微生物對紅棕象甲的防治效率提供了新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

紅棕象甲的實(shí)驗(yàn)室種群飼養(yǎng)于人工氣候培養(yǎng)箱(DRX-260，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，參數(shù)設(shè)置為：溫度27±1℃，相對濕度75%±5%，光周期12L∶12D。成蟲按1雌∶1雄配對置于圓柱狀透明塑料盒(直徑7 cm，高10 cm)內(nèi)，盒蓋有透氣小孔。盒內(nèi)放置新鮮的甘蔗片作為食物，然后將盒子放入培養(yǎng)箱，每3～4 d更換一次甘蔗片。更換甘蔗片后，將取出的舊甘蔗片小心剖開，用毛筆挑出蟲卵置于直徑為7 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，皿中鋪有潤濕的濾紙，然后將培養(yǎng)皿裝入紙盒避光放入培養(yǎng)箱待其孵化。待幼蟲孵化后，將孵化出的小幼蟲轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，每皿1頭幼蟲，并加入新鮮甘蔗片，同樣避光放入培養(yǎng)箱，每3～4 d更換一次甘蔗。幼蟲化蛹后，取出培養(yǎng)皿中的甘蔗片，加入干凈潮濕的甘蔗碎屑，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱待其羽化。其中部分4齡幼蟲用于后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2 紅棕象甲RfCTL-S1的序列分析

基于實(shí)驗(yàn)室前期從紅棕象甲轉(zhuǎn)錄組克隆獲得的RfCTL-S1序列(GenBank登錄號: MW538037)，使用ORF finder tool(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和ExPASy-Translate tool (https:∥web.expasy.org/translate/)分別預(yù)測紅棕象甲RfCTL-S1的開放閱讀框和其編碼的氨基酸序列，隨后采用在線分析工具SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測RfCTL-S1所含有的保守結(jié)構(gòu)域，使用軟件MEGA 5.2中的最大似然法分析RfCTL-S1與其他同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.3 紅棕象甲幼蟲體內(nèi)RfCTL-S1的組織表達(dá)譜分析

隨機(jī)選取長勢相同的紅棕象甲4齡幼蟲解剖獲得其不同組織(頭、體壁、前腸、中-后腸、血淋巴、脂肪體)，每種組織取3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)含3頭試蟲。參照Dawadi等(2018)描述的方法步驟，然后采用TRIzol法(ThermoFisher Scientific，美國)從上述組織中提取總RNA。用微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000, Thermo)和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量及濃度，符合要求的樣品-80℃保存?zhèn)溆?。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(B24403, 北京全式金生物科技有限公司)制備cDNA，保存在-20℃冰箱中備用。使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 3.0(http:∥bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(表1)。采用SYBR Green Master(Roche, Cat.No.04913850001)試劑盒在實(shí)時熒光定量PCR儀(Life Technology, 美國)上進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)總體系(20 μL)：上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL, cDNA模板1 μL, Super Mix 10 μL, 滅菌的去離子水8.4 μL。RT-qPCR溫度程序： 95℃預(yù)變性10 min; 變性95℃ 15 s, 61℃退火延伸1 min, 40個循環(huán)。以紅棕象甲的Rfβ-actin為內(nèi)參基因(Dawadietal., 2018)，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對表達(dá)量的計(jì)算。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 細(xì)菌注射感染后紅棕象甲幼蟲腸道和脂肪體中RfCTL-S1表達(dá)量的測定

為明確RfCTL-S1對細(xì)菌感染的響應(yīng)特征，我們使用大腸桿菌E.coliDH5α和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus分別注射感染(注射1 μL OD600=1.6的菌液)紅棕象甲的4齡幼蟲，注射PBS作為對照，然后在感染后的6，12和24 h解剖獲取腸道和脂肪體兩個組織并提取總RNA。每種處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)含3頭試蟲。每個處理取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA模板。引物序列見表1，RT-qPCR體系、試劑、反應(yīng)程序和相對表達(dá)量的計(jì)算方法同1.3節(jié)。

1.5 紅棕象甲RfCTL-S1的RNAi效果檢測

基于實(shí)驗(yàn)室前期從紅棕象甲轉(zhuǎn)錄組克隆獲得的RfCTL-S1全長序列(GenBank登錄號: MW538037)和dsEGFP，使用在線軟件E-RNAi (https:∥www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php)設(shè)計(jì)并評估篩選最佳引物(表1)，使用MEGAscript?RNAi試劑盒(ThermoFisher Scientific, 美國)合成靶向該基因和dsEGFP的dsRNA。用無菌水清洗4齡幼蟲蟲體，并將其放于冰上進(jìn)行冷凍麻醉處理3 min，然后用10 μL Hamilton注射器(WPI Corp., 美國)給每頭4齡幼蟲從腹部的節(jié)間膜注射1.5 μL dsRNA(667 ng/μL)，對照組試蟲注射等量的dsEGFP作為參照。注射處理的試蟲放回人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，48 h后解剖收集腸道和脂肪體并提取總RNA，利用表1中的特異性引物進(jìn)行RT-qPCR檢測基靶因的沉默效率和該基因沉默對4個抗菌肽基因表達(dá)的影響，總RNA提取方法、RT-qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.3節(jié)。每個處理4個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)含3頭試蟲。

1.6 RfCTL-S1被RNAi后紅棕象甲幼蟲血淋巴對細(xì)菌的清除能力檢測

根據(jù)Dawadi等(2018)的方法，注射dsRNA后的紅棕象甲4齡幼蟲先在1.1節(jié)正常飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)45 h后，然后注射2 μL EGFP標(biāo)記的大腸桿菌菌液(OD600=2.0)于幼蟲體腔內(nèi)，在1.1節(jié)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)3 h后在超凈工作臺中抽取血淋巴。每頭幼蟲抽取100 μL血淋巴置于含有3 μL α-苯基硫脲溶液(alpha-phenylthiourea, PTU) (5 mmol/L)的無菌EP管中，用無菌PBS進(jìn)行梯度稀釋1 000倍，隨后取稀釋液100 μL均勻涂布于含AMP的LB平板，LB平板倒置放于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后在Nikon ECLIPSE NI顯微鏡下統(tǒng)計(jì)每個平板上的細(xì)菌菌落數(shù)并拍照記錄，分析RfCTL-S1沉默對紅棕象甲血淋巴清除注射感染細(xì)菌能力的影響。每個處理4個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)含3頭試蟲。

1.7 RfCTL-S1被RNAi后紅棕象甲幼蟲腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)量檢測

解剖1.5節(jié)注射dsRNA 48 h后的試蟲獲取腸道，放入裝有1 mL無菌PBS緩沖液的無菌2 mL勻漿器，將混合液稀釋1 000倍，取出50 μL研磨均勻涂抹在牛肉膏胰蛋白胨營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar, NA)平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)(整個實(shí)驗(yàn)操作過程在超凈工作臺中進(jìn)行)，12 h后對菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個處理至少設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)含有健康的4齡幼蟲3頭。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析(ANOVA)檢測RfCTL-S1在不同組織中的表達(dá)量是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、注射細(xì)菌感染對RfCTL-S1在試蟲的腸道和脂肪體中表達(dá)量的影響以及RNAi對試蟲腸道和脂肪體中抗菌肽基因的表達(dá)影響。采用t檢驗(yàn)檢測處理組和對照組間RNAi效率、RNAi對注射細(xì)菌血淋巴清除能力和RNAi對腸道細(xì)菌的清除能力的差異顯著性。所有統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 21.0軟件完成，然后使用SigmaPlot 12.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 RfCTL-S1的序列特征

RfCTL-S1(GenBank登錄號: MW538037)的cDNA序列全長為728 bp，其開放閱讀框(ORF)長513 bp，編碼170個氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，該多肽沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，含有一個由16個氨基酸組成的信號肽和一個保守的CRD結(jié)構(gòu)域。與波斯果蠅Drosophilapersimilis、海德氏果蠅D.hydei、暗紋果蠅D.obscura和納沃果蠅D.navojoaCTLs的多重序列比對發(fā)現(xiàn)，RfCTL-S1和它們具有4個相同的半胱氨酸殘基，可以形成兩個二硫鍵，并且都含有EPN(Glu111-Pro112-Asn113)基序(圖1)，該基序可特異性識別結(jié)合甘露糖(Drickamer, 1992)。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，RfCTL-S1與米象Sitophilusoryzae的CTL聚為一支(圖2)，而且都是只含有一個CRD結(jié)構(gòu)域的CTL。上述結(jié)構(gòu)特征說明RfCTL-S1可能作為一種分泌型的可特異識別甘露糖的單CRD結(jié)構(gòu)域C-型凝集素參與調(diào)控紅棕象甲的免疫應(yīng)答。

圖1 紅棕象甲RfCTL-S1氨基酸序列與其他昆蟲CTLs的多重序列比對Fig. 1 Amino acid sequence alignment of RfCTL-S1 of Rhynchophorus ferrugineus with CTLs of other insectsCTLs的來源物種和GenBank登錄號Origin species of CTLs and their GenBank accession numbers: HsCTL: 人Homo sapiens, EAW86204.1; DpCTL-1: 波斯果蠅Drosophila persimilis, XP_002026132; DhCTL: 海德氏果蠅Drosophila hydei, XP_023164840; DoCTL: 暗紋果蠅Drosophila obscura, XP_022226692; DnCTL: 納沃果蠅Drosophila navojoa, XP_017957399; DpCTL-2: 波斯果蠅Drosophila persimilis, XP_026849736. 紅色表示完全保守氨基酸殘基；粉紅色表示相對保守氨基酸殘基；藍(lán)色方框表示EPN基序。Identical and similar amino acid residues are shaded in red and pink, respectively. The EPN motif is highlighted in a blue box.

圖2 基于氨基酸序列用最大似然法構(gòu)建的紅棕象甲RfCTL-S1與其他昆蟲CTLs的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of RfCTL-S1 of Rhynchophorus ferrugineus and CTLs from other insect species based on amino acid sequences by maximum likelihood method (1 000 replicates)

圖3 RfCTL-S1在紅棕象甲4齡幼蟲不同組織中的相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of RfCTL-S1 indifferent tissues of the 4th instar larvae ofRhynchophorus ferrugineus圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同字母表示不同組織間基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05, LSD)。Data in the figure are mean±SD. Different letters above each bar represent significant difference in the gene expression level among different tissues (P<0.05, LSD).

2.2 紅棕象甲幼蟲體內(nèi)RfCTL-S1的組織表達(dá)譜

RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，RfCTL-S1基因在紅棕象甲4齡幼蟲的頭、體壁、前腸、中-后腸、脂肪體和血淋巴中均有表達(dá)，在血淋巴中的表達(dá)量顯著高于在其他組織(P<0.05)(圖3)，說明RfCTL-S1這種C-型凝集素主要在血淋巴中表達(dá)產(chǎn)生，并可能參與介導(dǎo)紅棕象甲體內(nèi)相關(guān)的免疫反應(yīng)。

2.3 細(xì)菌注射感染對紅棕象甲幼蟲脂肪體和腸道中RfCTL-S1的表達(dá)量的影響

注射感染大腸桿菌6, 12和24 h后，紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體中RfCTL-S1的表達(dá)量與注射PBS的對照組相比有下調(diào)趨勢，其中24 h時顯著下調(diào)(F2,6=14.133，P<0.05)(圖4: A)；注射感染金黃色葡萄球菌6 h后，RfCTL-S1的表達(dá)量顯著高于24 h(F2,6=8.461,P<0.05)(圖4: A)。注射感染金黃色葡萄球菌12 h，紅棕象甲4齡幼蟲腸道中該基因的表達(dá)量顯著高于注射后6和24 h(F2,6=6.561,P<0.05)(圖4: B)。

2.4 RNAi干擾RfCTL-S1對紅棕象甲幼蟲脂肪體和腸道中抗菌肽基因表達(dá)的影響

注射dsRfCTL-S1 48 h后，紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體和腸道中的RfCTL-S1表達(dá)量均顯著低于注射dsEGFP的對照組(脂肪體:t6=4.804,P<0.05; 腸道:t6=2.671,P<0.05)(圖5)。dsRfCTL-S1對脂肪體和腸道中該基因的干擾效率分別達(dá)到64.8%和74.4%，表明注射dsRfCTL-S1能夠顯著地降低該基因在試蟲體內(nèi)的表達(dá)水平。

圖4 注射感染細(xì)菌的紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體(A)和腸道(B)中RfCTL-S1基因表達(dá)量的變化Fig. 4 Changes in the expression levels of RfCTL-S1 in the fat body (A) and gut (B) of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus upon challenge with different bacterial species by injection圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;柱上不同大寫字母和小寫字母分別表示同一處理不同時間點(diǎn)間和同一時間點(diǎn)不同處理間基因表達(dá)量的差異顯著(P<0.05, LSD)。Data in the figure are presented as mean±SD. Different capital and lowercase letters above bars represent significant difference in the gene expression level between different time points in the same treatment and across the different treatments at the same time point, respectively (P<0.05, LSD).

圖5 dsRfCTL-S1對紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體和腸道中RfCTL-S1的RNAi效率Fig. 5 RNAi efficiency of dsRfCTL-S1 to RfCTL-S1in the fat body and gut of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;柱上星號表示兩組之間有顯著性差異(P<0.05, t檢驗(yàn)). Data in the figure are presented as mean±SD. Asterisk above bars indicates significant difference between the two groups (P<0.05, t-test).

干擾RfCTL-S1基因48 h后，紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體中的抗菌肽基因RfColeoptericin,RfDefensin和RfCecropin的相對表達(dá)量均顯著低于對照組(RfColeoptericin:t6=6.943,P<0.05;RfDefensin:t6=2.465,P<0.05;RfCecropin:t6=4.007,P<0.05)，而抗菌肽基因RfAttacin的表達(dá)量則沒有顯著變化(t6=-1.113,P>0.05)(圖6: A)。上述數(shù)據(jù)表明干擾RfCTL-S1能夠顯著降低紅棕象甲幼蟲脂肪體中的RfColeoptericin,RfDefensin和RfCecropin3種抗菌肽基因的表達(dá)，進(jìn)而致使其血淋巴中的免疫反應(yīng)活性降低。在幼蟲腸道中，與對照組相比，4種抗菌肽基因RfAttacin,RfColeoptericin,RfDefensin和RfCecropin的表達(dá)量都沒有顯著變化(RfAttacin:t6=1.779,P>0.05;RfColeoptericin:t6=1.537,P>0.05;RfDefensin:t6=0.033,P>0.05;RfCecropin:t6=0.930,P>0.05)(圖6: B)，這說明RfCTL-S1在紅棕象甲的腸道免疫調(diào)控中沒有明顯作用。

2.5 RNAi干擾RfCTL-S1對紅棕象甲幼蟲血淋巴清除感染大腸桿菌能力的影響

RNAi干擾RfCTL-S1后，紅棕象甲4齡幼蟲血淋巴中EGFP標(biāo)記的大腸桿菌菌落數(shù)(CFU)為32 792.50±3 536.31，而對照組幼蟲血淋巴中被標(biāo)記的大腸桿菌CFU為19 057.50±8760.82，前者的數(shù)量顯著高于后者(t6=-2.908,P<0.05)(圖7: A)，表明RfCTL-S1的沉默顯著降低了血淋巴對細(xì)菌的清除能力。

2.6 RNAi干擾RfCTL-S1對紅棕象甲幼蟲腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)量的影響

干擾RfCTL-S1基因48 h后，棕象甲幼蟲腸道中的可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)(CFU)為383 889.00±33 217.00個，對照組試蟲腸道中分離獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)(CFU)為356 667.00±34 805.00個，兩組不存在顯著性差異(t6=-0.980,P=0.383)(圖7: B)，這暗示該基因編碼的凝集素RfCTL-S1可能在該害蟲腸道免疫的調(diào)控中沒有扮演重要角色。

圖6 RNAi干擾48 h RfCTL-S1對紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體(A)和腸道(B)中4種抗菌肽基因表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of RNAi of RfCTL-S1 for 48 h on the expression levels of four antimicrobial peptide genesin the fat body (A) and gut (B) of the 4th instar larvae of Rhynchophorus ferrugineus圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上星號和ns分別表示處理組與對照組(dsEGFP注射組)之間有顯著性差異(P<0.05)和無顯著性差異(P>0.05)(t檢驗(yàn))。圖7同。Data in the figure are presented as mean±SD. Asterisk and ns above bars indicate significant difference (P<0.05) and no significant difference (P>0.05), respectively, between the treatment group and the control group (dsEGFP injection group) (t-test). The same for Fig. 7.

圖7 RNAi干擾48 h RfCTL-S1對紅棕象甲4齡幼蟲血淋巴中EGFP標(biāo)記的大腸桿菌菌落數(shù)(A)和腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)(B)的影響Fig. 7 Effect of RNAi of RfCTL-S1 for 48 h on the number of EGFP-tagged Escherichia coli colonies in the hemolymph (A) andthe number of cultivable bacterial colonies in the gut (B) of the 4th instar larvae of Rhynchophorus ferrugineus

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)紅棕象甲RfCTL-S1編碼的多肽具有一個信號肽和CRD功能結(jié)構(gòu)域(圖1)，但是沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，表明RfCTL-S1編碼的多肽是一種分泌型C-型凝集素。已有研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲C-型凝集素的CRD中存在兩種基序——EPN和QPD(Huangetal., 2015)，這些基序可以通過氫鍵與病原微生物表面的糖配體結(jié)合(Zhangetal., 2009; Brownetal., 2018)。例如，EPN基序中的Glu和Asn通過與甘露糖上的3-OH和4-OH形成氫鍵決定CRD與該糖的結(jié)合特異性(Drickamer, 1992; Weietal., 2012)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RfCTL-S1編碼的多肽中含有EPN基序，這暗示RfCTL-S1可能特異性地結(jié)合細(xì)菌表面的甘露糖，從而介導(dǎo)調(diào)控該害蟲對相關(guān)病原微生物的免疫反應(yīng)。

在昆蟲體內(nèi)，血淋巴中含有豐富的血細(xì)胞，是系統(tǒng)性免疫反應(yīng)發(fā)生的重要場所，在昆蟲抵抗病原體入侵的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用(Holmskovetal., 2003)。組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，RfCTL-S1基因在紅棕象甲血淋巴中的表達(dá)豐度最高(圖3)，這暗示這種凝集素主要由紅棕象甲的血細(xì)胞合成分泌。而且已有研究證實(shí)，家蠶的BmLBP和BmCTL-S3以及赤擬谷盜Triboliumcastaneum的CTL3和CTL6等多種CTLs都是作為分泌型PRR存在于血淋巴中參與調(diào)控它們的免疫過程(Zhanetal., 2016; Lietal., 2021)。因此，該結(jié)果暗示RfCTL-S1可能是作為一種分泌型PRR參與介導(dǎo)調(diào)控紅棕象甲的系統(tǒng)性免疫反應(yīng)。

對入侵病原體的免疫識別是昆蟲先天免疫中最關(guān)鍵的第一步。大量證據(jù)表明，C-型凝集素能夠快速識別并結(jié)合病原體表面的糖類物質(zhì)(Brownetal., 2018)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RfCTL-S1含有EPN基序，而該基序已被證實(shí)能特異性結(jié)合甘露糖(Drickamer, 1992)，而且具有EPN基序的C-型凝集素也具有具有結(jié)合脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和肽聚糖(peptidoglycan, PGN)等多種不同糖類的能力(Brownetal., 2018)。本研究利用革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌分別注射感染紅棕象甲幼蟲探究RfCTL-S1的響應(yīng)模式。結(jié)果表明，在脂肪體中RfCTL-S1對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌注射感染分別表現(xiàn)為上調(diào)和下調(diào)，并且該基因?qū)Ω锾m氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的響應(yīng)比腸道中更為迅速(圖4: A)。以上結(jié)果表明紅棕象甲RfCTL-S1可能參與介導(dǎo)該害蟲對這兩種細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)。注射大腸桿菌后，紅棕象甲幼蟲中的RfCTL-S1表達(dá)量下調(diào)(圖4)，這與注射副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus感染羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii導(dǎo)致其體內(nèi)的EsCTL1和EsCTL2表達(dá)量降低的情況(Huangetal., 2015)類似，說明RfCTL-S1可能是一種調(diào)理素(opsonin)，感染細(xì)菌誘導(dǎo)紅棕象甲幼蟲體內(nèi)的RfCTL-S1下調(diào)表達(dá)來延緩寄主免疫系統(tǒng)對其的攻擊(Eddie Ipetal., 2009)。然而，注射金黃色葡萄球菌后，該基因上調(diào)表達(dá)，這與赤擬谷盜TcCTL5結(jié)果一致，說明RfCTL-S1可能與TcCTL5具有相似的功能，可以作為一種PRR識別感染細(xì)菌激活該蟲的免疫進(jìn)而誘導(dǎo)抗菌肽的表達(dá)(Lietal., 2021)。因此，這些數(shù)據(jù)說明RfCTL-S1可以響應(yīng)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的感染，而且可能以不同的角色響應(yīng)不同種類細(xì)菌的感染。兩種不同細(xì)菌感染引起的RfCTL-S1不同表達(dá)模式是否與革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁種甘露糖的含量差異有關(guān)？該問題值得待進(jìn)一步探究。

RfCTL-S1被沉默后，紅棕象甲幼蟲的血淋巴清除EGFP標(biāo)記大腸桿菌的能力被顯著地抑制(圖7： A)。CTL作為一種PRR，它可以通過調(diào)控AMPs的表達(dá)來介導(dǎo)昆蟲的先天免疫反應(yīng)(畢京秀, 2020)。而且已有證據(jù)表明，昆蟲AMPs對細(xì)菌、真菌和病毒都具明顯的抑制活性(張明明等, 2012)。本文研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RfCTL-S1被沉默后，脂肪體中的RfCecropin,RfColeoptericin和RfDefensin3種抗菌肽基因的表達(dá)量都顯著低于對照組(圖6: A)，說明RfCTL-S1參與激活脂肪體中上述3個AMP基因的表達(dá)。而RfCTL-S1的沉默對腸道中可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落數(shù)(圖7: B)和腸道中AMPs表達(dá)豐度(圖6: B)均無顯著影響，說明紅棕象甲RfCTL-S1可能主要在其系統(tǒng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，紅棕象甲RfCTL-S1是一種具有信號肽和一個含EPN基序CRD的C-型凝集素，而且該多肽的編碼基因主要在血細(xì)胞中表達(dá)。革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的感染能顯著誘導(dǎo)RfCTL-S1在脂肪體中的表達(dá)。RfCTL-S1的沉默導(dǎo)致脂肪體中抗菌肽RfColeoptericin,RfDefensin和RfCecropin的表達(dá)豐度顯著下降，進(jìn)而造成該害蟲血淋巴清除感染細(xì)菌能力的下降。但是RfCTL-S1的沉默對腸道中的可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)和抗菌肽基因的表達(dá)均無影響。因此，這些結(jié)果表明RfCTL-S1是一種分泌型免疫識別受體，可以通過介導(dǎo)抗菌肽基因的表達(dá)參與調(diào)控紅棕象甲的系統(tǒng)免疫反應(yīng)。然而，RfCTL-S1調(diào)控抗菌肽產(chǎn)生的分子機(jī)制還不清楚，還有待進(jìn)一步解析。