賴妙玲，廖德貴，曾嘉敏，郅 程，唐 甜

胃幽門螺桿菌(helicobacter pylori, HP)是人類常見(jiàn)的感染菌之一，與胃炎、胃潰瘍、胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[1-3],我國(guó)自然人群HP平均感染率較高[1]。因此，準(zhǔn)確、快速、便捷地檢出HP感染情況，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，對(duì)預(yù)防胃癌的發(fā)生有重要意義。目前，檢測(cè)HP的方法較多，但敏感性和特異性有一定差異。本文采用美藍(lán)染色、免疫組化染色及熒光染色檢測(cè)胃活檢標(biāo)本HP的感染情況，并分析其病理診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年1月～2020年7月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院存檔的胃鏡活檢標(biāo)本200例，其中男性110例，女性90例，年齡21～82歲，平均(56.5±12.0)歲。組織學(xué)分型包括黏膜慢性炎癥172例，息肉28例。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，包埋，切片。本組標(biāo)本分別行胃HP美藍(lán)染色、熒光染色、免疫組化染色。由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師評(píng)估，美藍(lán)染色及免疫組化染色采用光鏡觀察，熒光染色采用熒光顯微鏡觀察。在胃小凹或腺腔等部位觀察到弧形短桿狀、逗點(diǎn)狀、“S”形、“C”形、“海鷗狀”散在或簇狀分布的細(xì)菌判定為HP陽(yáng)性。由于免疫組化染色是在蛋白水平檢測(cè)HP菌體，具有高度的特異性和敏感性，故本實(shí)驗(yàn)以免疫組化檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，其它檢測(cè)方法與之比較[2-3]。判讀方法參考中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)(2017版)[1]：陰性為切片上未見(jiàn)HP；“1+”為偶見(jiàn)或小于標(biāo)本全長(zhǎng)1/3有少數(shù)HP；“2+”為HP分布超過(guò)標(biāo)本全長(zhǎng)1/3而未達(dá)2/3或連續(xù)性、薄而稀疏地存在于上皮表面；“3+”為HP成堆存在，基本分布于標(biāo)本全長(zhǎng)。

1.2.1胃HP美藍(lán)染色 采用美藍(lán)法染色，試劑購(gòu)于Baso公司，3 μm厚連續(xù)切片，脫蠟至水，滴加美藍(lán)液，染色10 min，流水沖洗，干燥，透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.2胃HP熒光染色 采用直接法染色，試劑購(gòu)于諾鬲公司，3 μm厚連續(xù)切片，脫蠟至水，滴加HP染色液，蓋上蓋玻片，染色1 min，熒光顯微鏡下判讀。

1.2.3免疫組化染色 HP抗體(兔多克隆，即用型)購(gòu)于深達(dá)公司，3 μm厚連續(xù)切片，采用羅氏公司Ventana BenchMark Ultra全自動(dòng)免疫組化儀染色，二抗檢測(cè)系統(tǒng)為Optiview DAB IHC Detection kit(簡(jiǎn)稱OV)。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作：Ultra CC1(pH 8.0)99 ℃修復(fù)32 min，一抗37 ℃孵育32 min，OV linker 12 min，OV HRP Multimer 12 min，蘇木精12 min，靛藍(lán)12 min，光鏡下判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；檢測(cè)結(jié)果一致性分析，采用κ系數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定性分析HP的檢測(cè)美藍(lán)染色：HP被染成藍(lán)色(圖1)，陽(yáng)性率為75%(150/200)。熒光染色：在暗背景下，HP呈橙紅色(圖2)，陽(yáng)性率為79%(158/200)。免疫組化染色：HP呈棕褐色(圖3)，陽(yáng)性率為68.5%(137/200)。熒光染色的HP檢出率最高，而免疫組化染色的檢出率最低。熒光染色結(jié)果158例陽(yáng)性樣本，有12例美藍(lán)染色及免疫組化染色結(jié)果為陰性，熒光染色的假陽(yáng)性率為8.2%(12/158)；美藍(lán)染色的假陽(yáng)性率為2%(3/150)。三種方法相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.053，圖4)。

①②③圖1 胃黏膜活檢標(biāo)本HP檢測(cè):HP呈藍(lán)色,美藍(lán)染色 圖2 胃黏膜活檢標(biāo)本HP檢測(cè):HP呈橙紅色,熒光染色圖3 胃黏膜活檢標(biāo)本HP檢測(cè):HP呈棕褐色,免疫組化染色

2.2 半定量分析HP的檢測(cè)本組結(jié)果顯示，HP的免疫組化染色陰性率及“3+”的陽(yáng)性率明顯高于美藍(lán)染色及熒光染色，三者的染色結(jié)果相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。一致性分析顯示：三種方法的診斷結(jié)果一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩兩間的診斷結(jié)果一致性差(表1)。

圖4 不同方法檢測(cè)胃黏膜活檢標(biāo)本HP的感染情況

表1 不同檢測(cè)方法檢測(cè)HP感染的一致性分析

2.3 不同方法檢測(cè)HP感染的一致性分析200例樣本中，采用免疫組化與美藍(lán)染色法檢測(cè)HP感染情況，兩者均為陽(yáng)性者137例；免疫組化與熒光染色法比較，HP均為陽(yáng)性者135例。一致性分析結(jié)果顯示，免疫組化與美藍(lán)染色(κ=0.840)、熒光染色(κ=0.682)HP檢測(cè)結(jié)果的一致性較好，但美藍(lán)染色與免疫組化的檢測(cè)結(jié)果一致性更高(表2)。

表2 不同檢測(cè)方法間HP檢測(cè)定性結(jié)果一致性分析

2.4 HP感染與臨床特征的關(guān)系HP檢測(cè)結(jié)果與患者年齡、性別有關(guān)，60歲以下者發(fā)病率明顯高于60歲以上者，男性發(fā)病率明顯高于女性。172例有重度炎癥HP的感染率為：55.2%(美藍(lán)染色)、57.0%(熒光染色)、52.9%(免疫組化染色)，高于中、輕度炎癥。無(wú)腸化生HP的感染率為：54.7%(美藍(lán)染色)、54.1%(熒光染色)、50.6%(免疫組化)，高于重、中、輕度腸化生。HP的感染率與炎癥程度、活動(dòng)度呈正相關(guān)，與腸化生的程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，圖5)。

圖5 HP感染與臨床病理診斷的關(guān)系：A. HP感染與炎癥程度的關(guān)系；B. HP感染與活動(dòng)程度的關(guān)系；C. HP感染與腸化生的關(guān)系

2.5 碳-14呼氣試驗(yàn)與胃黏膜活檢標(biāo)本HP感染的一致性分析200例活檢標(biāo)本中，70例(35%)患者接受碳-14呼氣試驗(yàn)，有41例患者呼氣試驗(yàn)提示有HP感染，陽(yáng)性率為58.6%(41/70)，低于活檢標(biāo)本檢出率。一致性分析結(jié)果顯示，呼氣試驗(yàn)與其它三種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性較差，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 免疫組化染色中生發(fā)中心HP的表達(dá)200例樣本中，有4例(2%)樣本的HP免疫組化染色生發(fā)中心出現(xiàn)不同程度的表達(dá)(圖6)。

AB

3 討論

第五次全國(guó)HP感染處理共識(shí)提出，HP陽(yáng)性患者需進(jìn)行HP根治治療[4]。因此，HP的檢測(cè)顯得尤為重要。目前，診斷HP感染的方法較多，主要分為侵入性和非侵入性[5-6]。非侵入性方法簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)，其中尿素呼氣試驗(yàn)最為常用。侵入性方法需經(jīng)胃鏡引導(dǎo)，有一定的創(chuàng)傷性，可進(jìn)行病理活檢，能夠更好地發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)病灶。有研究顯示[7]，采用胃鏡檢查和胃活檢標(biāo)本評(píng)估HP的感染情況，其特異性和敏感性約100%。病理活檢以發(fā)現(xiàn)HP作為診斷依據(jù)，是HP相關(guān)胃炎評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。本院常用的診斷方法有病理活檢及尿素呼氣試驗(yàn)。

日常工作中，除HE染色外，常加做美藍(lán)染色進(jìn)行檢測(cè)[7-8]。隨著病理技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫組化和熒光染色在臨床的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。免疫組化也能用于細(xì)菌、病毒(如HP、CMV、SV40等)的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)采用美藍(lán)染色、熒光染色及免疫組化染色檢測(cè)200例疑似HP感染的活檢標(biāo)本，以HP的免疫組化結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，其它方法與之對(duì)比。結(jié)果顯示，熒光染色的陽(yáng)性率高于美藍(lán)染色和免疫組化染色。有研究顯示[9-10]，免疫組化染色對(duì)HP的敏感性和特異性明顯高于HE及美藍(lán)染色。但本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色的檢出率低于另兩種染色，主要集中在“1+”的病例，可能因菌量不多所致。一致性分析顯示，三種方法的檢測(cè)結(jié)果一致性較強(qiáng)，但免疫組化與美藍(lán)染色的一致性最高。

另外，免疫組化能夠檢測(cè)出生發(fā)中心HP蛋白的表達(dá)。Nelson等[11]發(fā)現(xiàn)采用免疫組化法除了能觀察HP菌體外，還能觀察到5%的病例生發(fā)中心出現(xiàn)HP的表達(dá)，但該表達(dá)不是HP菌體，而是機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答可以在感染時(shí)或治療后出現(xiàn)，其與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。但是美藍(lán)染色以及熒光染色則不能提示。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HP的感染率與炎癥程度、活動(dòng)度呈正相關(guān)，而與腸化生呈負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7,12]。有研究顯示胃炎萎縮程度與HP的感染有關(guān)[12-13]，但本組并未發(fā)現(xiàn)，可能未對(duì)HP進(jìn)行分類所致。

綜上所述，雖然三種檢測(cè)方法HP的檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性，但在日常工作中，應(yīng)選擇快捷、特異、敏感及準(zhǔn)確率高、易于判讀的方法。隨著全自動(dòng)免疫組化技術(shù)的發(fā)展，HP的免疫組化檢測(cè)結(jié)果更穩(wěn)定，可重復(fù)性高，為HP免疫組化檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保障。因此，HP的免疫組化檢測(cè)方法可在日常工作中推廣。