常玉清，方建晨，馮蔚鷹，陳海仁，丁 祺，馮礪錦，葛 榮

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是常見的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)，約占我國成人淋巴瘤的40%。依據(jù)其免疫組化和基因特征，將其分為GCB型和non-GCB型[1]。70%的DLBCL患者可通過實(shí)用蒽環(huán)類藥物化療獲得緩解，但只有50%～60%的患者可實(shí)現(xiàn)長期無瘤生存，不同患者對藥物反應(yīng)差異較大[2]。近年，隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)某些基因的異常表達(dá)對DLBCL的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等具有重要影響。FISH檢測C-MYC基因易位同時伴BCL-2或BCL-6基因易位的DLBCL稱為雙重打擊淋巴瘤(double-hit lymphomas, DHL)，三種易位同時發(fā)生則稱為三重打擊淋巴瘤(triple-hit lymphomas, THL)[3]。如果僅檢測蛋白過度表達(dá)而無基因易位，則稱為雙表達(dá)淋巴瘤(double-expressor lymphoma, DEL)。DLBCL中DHL和THL惡性程度更高，預(yù)后更差[4]。本研究采用免疫組化染色及FISH檢測205例DLBCL中C-MYC、BCL-2和BCL-6蛋白表達(dá)和基因易位情況，探討三者與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系，為患者治療和預(yù)后評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2011年11月～2020年4月上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院病理科、上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院病理科、寧波市臨床病理診斷中心及上海同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民院病理科確診的205例DLBCL，均符合WHO(2016)造血和淋巴組織腫瘤分類的診斷標(biāo)準(zhǔn)，有完整的病理資料。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，患者均知情同意。

1.2 免疫組化及原位雜交標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，分別行HE及免疫組化EnVision法染色及EBER原位雜交。采用羅氏Benchmark XT Ventanna全自動免疫組化儀染色，抗體C-MYC、BCL-2、BCL-6均購自DAKO公司。陽性率以陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞百分比計算，所有切片均由兩名高年資病理醫(yī)師共同閱片。腫瘤組織中C-MYC陽性細(xì)胞數(shù)≥40%、BCL-2陽性細(xì)胞數(shù)≥50%、BCL-6陽性細(xì)胞數(shù)≥30%為染色陽性[5]。

1.3 FISH法根據(jù)HE染色選擇腫瘤區(qū)域，采用雙色熒光原位雜交檢測。C-MYC、BCL-2和BCL-6雙色分離探針，均購自美國Vysis公司，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。使用Zeiss Axioimager熒光顯微鏡在高倍視野(100×)記錄至少100個腫瘤細(xì)胞核信號。探針均由紅色熒光探針和綠色熒光探針兩部分組成，正常細(xì)胞顯示2個黃色融合信號或緊鄰的2個紅綠信號，基因易位顯示1個黃色信號和1紅1綠分離信號，當(dāng)分離信號比例>10%時判為陽性，同一細(xì)胞核內(nèi)黃色融合信號≥3個為基因多拷貝。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；等級資料采用秩和檢驗(yàn)與χ2檢驗(yàn)，當(dāng)不滿足χ2檢驗(yàn)條件時，采用Fisher確切概率法比較臨床病理特征的計數(shù)資料。應(yīng)用Kaplan-Meier法分析患者的生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較各組間的生存率是否存在差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征205例DLBCL中男性106例，女性99例，男女比為1.07 ∶1?；颊甙l(fā)病年齡18～93歲，中位年齡60歲，平均49.6歲；<60歲者99例，≥60歲者106例。有隨訪資料者171例，隨訪時間8～107個月，死亡48例，病死率為28.1%。

2.2 免疫表型及原位雜交C-MYC和BCL-6陽性染色定位于細(xì)胞核內(nèi)，BCL-2陽性染色定位于胞質(zhì)及胞膜(圖1)。本組按Hans分型有76例GCB型(37.1%)，129例non-GCB型(62.9%)。根據(jù)C-MYC與BCL-2的表達(dá)，將患者分為雙表達(dá)組91例(44.4%)及普通組114例(55.6%)。雙表達(dá)組GCB型患者比例為28.5%(26/91)低于普通組的43.8%(50/114)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本組DHL和THL合計5例(2.44%，5/205)，2例為DHL、3例為THL，與普通組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者年齡及性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。EBER原位雜交陽性位于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕褐色、棕黃色或淺黃色。本組病例EBER原位雜交均陰性。

表1 DLBCL中雙表達(dá)組與普通組臨床資料比較

2.3 C-MYC基因易位檢測本組205例DLBCL中有204例行C-MYC基因易位檢測，其中19例(9.3%)檢測有C-MYC易位(圖2A)；其中雙表達(dá)組17例，普通組2例。GCB型中C-MYC易位占12.0%(9/75)，non-GCB型中C-MYC易位占7.8%(10/129)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。C-MYC易位患者中男性7例(7/106，6.6%)，女性12例(12/98，12.2%)；<60歲者9例(9/102，8.8%)，≥60歲者10例(10/102，9.8%)，不同年齡和性別組的C-MYC易位差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。上述結(jié)果表明C-MYC易位與分組有關(guān)(P<0.001)，與Hans分型、年齡和性別無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表2 C-MYC基因易位情況比較

2.4 BCL-2基因易位檢測本組有182例患者接受BCL-2基因易位檢測，發(fā)現(xiàn)16例BCL-2易位(圖2B)，其中雙表達(dá)組12例，普通組4例，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017)；GCB型患者12例(12/70，17.1%)，non-GCB型4例(4/112，3.6%)，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02，表3)。男性7例(7/96，7.3%)，女性9例(9/86，10.5%)；<60歲者7例(7/89，7.9%)，≥60歲者9例(9/93，9.7%)，BCL-2基因易位的年齡及性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

①A①B①C②A②B②C

表3 BCL-2基因易位情況比較

2.5 BCL-6基因易位檢測本組179例患者接受BCL-6基因易位檢測，有54例(30.16%)檢測到BCL-6易位(圖2C)。其中雙表達(dá)組29例，普通組26例；GCB型患者17例(17/70，24.3%)，non-GCB型37例(37/109，33.9%)，兩組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.186，表4)。BCL-6易位男性26例，女性28例；<60歲者26例，≥60歲者28例；BCL-6易位在年齡及性別間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表4 BCL-6基因易位情況比較

2.6 DHL或THL的臨床病理特征本組有2例DHL、3例THL，年齡37～67歲，平均58.4歲，中位年齡65歲，占所有患者的2.44%(5/205)。5例患者中GCB組有4例，包括1例DHL(BCL-2+C-MYC)和3例THL；non-GCB組有1例DHL(BCL-2+C-MYC)。其中1例患者C-MYC基因拷貝數(shù)>3，其余4例基因拷貝數(shù)均<3。但因可統(tǒng)計拷貝數(shù)的樣本較少，無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7 DLBCL臨床病理特征與腫瘤基因易位、患者預(yù)后的關(guān)系本組結(jié)果顯示：腫瘤分型與患者預(yù)后明顯相關(guān)，GCB型的預(yù)后明顯好于non-GCB型(P<0.01，圖3A)；與<60歲者相比，年齡≥60者生存率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3B)。雙表達(dá)組及DHL/THL組總體預(yù)后低于普通組(圖3C、D)；而患者性別及C-MYC、BCL-6、BCL-2基因易位與預(yù)后無相關(guān)性(圖3E～H)。

表5 DHL或THL的臨床病理特征

圖3 A.Hans分型與患者生存期的關(guān)系；B.患者年齡與生存期的關(guān)系；C.患者分組與生存期的關(guān)系；D.DHL/THL與患者生存期的關(guān)系；E.患者性別與患者生存期的關(guān)系；F.C-MYC基因易位與患者生存期的關(guān)系；G.BCL-6基因易位與患者生存期的關(guān)系；H.BCL-2基因易位與患者生存期的關(guān)系

3 討論

DLBCL是成人常見的淋巴瘤，約占新發(fā)NHL的1/4[6]。近年全球NHL發(fā)病率每年以2%～4%的速度增長[7]，其中以DLBCL多見。DLBCL異質(zhì)性強(qiáng)，具有復(fù)雜的基因改變，C-MYC、BCL-2及BCL-6基因改變對治療及預(yù)后具有重要影響[8]。

C-MYC是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)參與DNA損傷和修復(fù)有關(guān)的基因表達(dá)，并參與細(xì)胞從G1到S期進(jìn)程和細(xì)胞末端分化，其基因一旦發(fā)生重排或擴(kuò)增，對細(xì)胞功能具有重要影響，能夠促進(jìn)腫瘤性轉(zhuǎn)變[8]。在淋巴瘤中，常見的MYC基因改變是t(8; 14)(q24; q32)，最初作為Burkitt淋巴瘤的特異性標(biāo)志，有文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn)10%～15%的DLBCL也可發(fā)生MYC基因改變[9]。C-MYC基因與DLBCL的高侵襲性密切相關(guān)，這些患者用傳統(tǒng)方案治療效果不理想，預(yù)后較差[10]。本組共檢測出19例C-MYC基因異位，陽性率約9.3%，與文獻(xiàn)報道相似[9]。C-MYC基因異位與Hans分型及患者年齡、性別等均無相關(guān)性，本組C-MYC基因易位患者預(yù)后較好，可能與樣本量和隨訪時間較短有關(guān)。

BCL-2有抑制細(xì)胞凋亡的作用，其過表達(dá)使細(xì)胞抵抗正常凋亡，從而具有致瘤作用[11]。在80%～90%的濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma, FL)中可見BCL-2易位，F(xiàn)L中t(14；18)(q32；q21)/IgH-BCL-2具有特異性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，15%～20%的DLBCL患者也有類似基因改變，其在GCB型DLBCL中更為常見[9]。BCL-2重排的預(yù)后意義一直有爭議，有報道認(rèn)為該基因易位與患者預(yù)后無關(guān)[5]，而也有研究者認(rèn)為BCL-2易位患者預(yù)后較差[13]。BCL-6屬于抗細(xì)胞凋亡家族，其主要功能是轉(zhuǎn)錄抑制作用[14]。BCL-6基因突變和染色體易位是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，異常表達(dá)BCL-6可直接調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡，促進(jìn)腫瘤生長導(dǎo)致生發(fā)中心衍生的B細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[15]。BCL-6易位t(3q27)占DLBCL的35%[16]。本組有182例患者進(jìn)行BCL-2基因檢測，陽性率為8.8%(16/182)，其中GCB型患者陽性率為17.1%(12/70)，明顯高于non-GCB型患者(4/112，3.6%)，這與Chen等[17]研究結(jié)果一致。本組BCL-2基因易位與患者年齡、性別及預(yù)后無相關(guān)性；而BCL-6基因易位陽性率為30.16%(54/179)，其與腫瘤Hans分型、性別、年齡及預(yù)后均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

WHO(2016)淋巴瘤分類定義高級別B細(xì)胞淋巴瘤具有C-MYC和BCL-2和(或)BCL-6基因重排時，被稱為DHL和THL[18]；少數(shù)高級別B細(xì)胞淋巴瘤沒有雙重/三重打擊，以及不宜歸入DLBCL非特指型或Burkitt淋巴瘤范疇，被定義為高級別B細(xì)胞淋巴瘤非特指型[19]。DHL/THL是具有高度侵襲性、核型復(fù)雜以及一系列病理形態(tài)學(xué)特征的少見腫瘤，惡性程度高，預(yù)后差，對常規(guī)治療方案不敏感，使用標(biāo)準(zhǔn)化療方案R-CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松和利妥昔單抗化療)治療后，預(yù)后較差[20]。因此，正確診斷DHL/THL對制定合適的治療方案十分重要。

FISH檢測是DHL/THL診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其耗時長、費(fèi)用高，對實(shí)驗(yàn)室有特殊要求[21]。免疫組化檢測蛋白的表達(dá)方便、快捷，且價格低廉。WHO(2016)淋巴瘤分類中，C-MYC和BCL-2雙表達(dá)被認(rèn)為是一個新的亞組，被定義為DEL，約占DLBCL的1/3[22-25]。Swerdlow[26]研究表明，70%～80%的DHL或THL也顯示“雙重表達(dá)”，但DEL并不等同于DHL，比DHL更常見。本組根據(jù)患者C-MYC及BCL-2蛋白表達(dá)，將患者分為雙表達(dá)組和普通組，90%的DHL發(fā)生于雙表達(dá)患者中，也進(jìn)一步說明DEL與DHL的關(guān)系。本組DHL的發(fā)生率為4.8%，與Oliveira等[27]報道類似；且雙表達(dá)組及DHL、THL組總預(yù)后低于普通組。

總之，C-MYC與BCL-2蛋白表達(dá)對其基因易位有提示作用，而BCL-6蛋白表達(dá)不能預(yù)測其基因易位情況；C-MYC、BCL-2及BCL-6基因易位(包括雙重打擊及三重打擊)可作為DLBCL患者的預(yù)后指標(biāo)。