盛仁明，侯 燕，劉加豪，張永勝，涂 健

前列腺癌是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤，早期前列腺癌局限于前列腺內(nèi)，預(yù)后較好，若發(fā)生轉(zhuǎn)移較難診治。AR信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)前列腺癌的進(jìn)展至關(guān)重要，去勢(shì)治療是前列腺癌的重要治療手段，而去勢(shì)抵抗性前列腺癌是患者發(fā)生耐藥及死亡的重要原因[1]。Plexin-B1是信號(hào)素Sema4D的跨膜受體[2]，其在前列腺癌中通過(guò)Sema4D/Plexin-B1信號(hào)通路激活HER-2以及雄激素受體，促進(jìn)腫瘤的侵襲性[3]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法染色、qRT-PCR法檢測(cè)Plexin-B1 蛋白和mRNA在前列腺癌和良性前列腺組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與前列腺癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2009年1月～2011年1月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔的82例前列腺癌組織和46例良性前列腺組織，前列腺癌的組織學(xué)類(lèi)型均為腺泡腺癌。82例前列腺癌患者年齡55～94歲，平均72.9歲，>70歲者51例，≤70歲者31例。按照AJCC(2017)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ+Ⅱ期者35例，Ⅲ+Ⅳ期者47例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例?；颊呔?jīng)手術(shù)切除治療，術(shù)前均未行放、化療或抗雄激素等治療。按WHO/ISIP(2016)分級(jí)分組系統(tǒng)[4]將前列腺癌分為1～5組。82例前列腺癌患者隨訪3～120個(gè)月。

1.2 試劑Plexin-B1兔抗人抗體購(gòu)自Abcam公司，AR的兔抗人多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司。免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋公司。Trizol提取試劑盒購(gòu)自上海宏生生物公司，qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物公司。

1.3 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色采用EnVision法，一抗包括Plexin-B1(1 ∶200)、AR(1 ∶300)，4 ℃孵育過(guò)夜，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性染色的前列腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

Plexin-B1陽(yáng)性結(jié)果判斷參考文獻(xiàn)[5-6]進(jìn)行：(1)按陽(yáng)性細(xì)胞染色程度計(jì)分：不著色或顯色不清為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：總分<3分為陰性(-)，≥3且<6分為陽(yáng)性(+)，≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.4 qRT-PCR采用Trizol試劑盒提取20對(duì)前列腺癌和良性前列腺組織的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測(cè)Plexin-B1 mRNA基因的表達(dá)。Plexin-B1引物序列：上游5′-GGCGAGGATA CACCAGCAG-3′，下游5′-GTGCAAAGGCACTCACG AA-3′。內(nèi)參β-actin引物序列：上游5′-CACCATTG GCAATGAGCGGTTCC-3′，下游5′-GTAGTTTCGTG GATGCCACAGG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)；進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，配對(duì)資料的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌和良性前列腺組織中Plexin-B1的表達(dá)Plexin-B1陽(yáng)性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞胞核，胞質(zhì)淺著色，間質(zhì)細(xì)胞未著色。前列腺癌組織中Plexin-B1的陽(yáng)性率為74.39%(61/82)。良性前列腺組織中Plexin-B1的陽(yáng)性率為10.87%(5/46)。前列腺癌組織中Plexin-B1陽(yáng)性率顯著高于良性前列腺組織，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1，圖1)。

表1 前列腺癌和良性前列腺組織中Plexin-B1的表達(dá)

AB

2.2 前列腺癌組織中Plexin-B1的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系臨床分期Ⅰ+Ⅱ期前列腺癌中Plexin-B1的陽(yáng)性率為61.54%，Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌中Plexin-B1的陽(yáng)性率為86.05%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)。WHO/ISUP(2016)分級(jí)分組中1～5組前列腺癌的Plexin-B1蛋白陽(yáng)性率分別為75.00%、70.00%、60.00%、83.33%、82.35%，5組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，Plexin-B1蛋白表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、脈管及神經(jīng)有無(wú)侵犯等均無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 前列腺癌組織中Plexin-B1的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 前列腺癌及良性前列腺組織中Plexin-B1 mRNA的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)前列腺癌和良性前列腺組織，結(jié)果顯示：Plexin-B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在前列腺癌中為(267.15±57.06)%，在良性前列腺組織中為(100.00±19.02)%。這提示Plexin-B1 mRNA在前腺癌組織中的表達(dá)水平高于良性前列腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 Plexin-B1表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，Plexin-B1高表達(dá)組10年生存率為55.74%，Plexin-B1低表達(dá)組10年生存率為85.71%。結(jié)果表明，前列腺癌組織中Plexin-B1高表達(dá)組的生存率低于Plexin-B1低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019，圖2)。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析Plexin-B1表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 前列腺組織中Plexin-B1與AR表達(dá)的相關(guān)性免疫組化檢測(cè)Plexin-B1和AR在前列腺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示：Plexin-B1陽(yáng)性組AR陽(yáng)性率為86.89%，Plexin-B1陰性組AR陽(yáng)性率為61.90%。Spearsman等級(jí)相關(guān)分析顯示，Plexin-B1與AR的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.275，P=0.012，表3)。

表3 前列腺癌組織中Plexin-B1和AR表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

脊椎動(dòng)物中Plexin蛋白家族有9個(gè)成員，分成4個(gè)亞組，包括：Plexin-A、Plexin-B、Plexin-C、Plexin-D；其中Plexin-B有3個(gè)成員：Plexin-B1、Plexin-B2和Plexin-B3。Plexin-B1屬于跨膜蛋白分子，其由2 315個(gè)氨基酸組成，mRNA長(zhǎng)7 097 bp，其cDNA長(zhǎng)6 467 bp[7]。研究證實(shí)Plexin-B1在惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌、鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道，Plexin-B1蛋白作為Sema4D的受體在多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管新生等方面發(fā)揮重要作用[10-11]。目前，Plexin-B1與前列腺癌的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Plexin-B1在前列腺癌細(xì)胞膜、胞質(zhì)和胞核中高表達(dá)，尤以細(xì)胞核的表達(dá)水平最高，提示Plexin-B1可能在前列腺癌中起作用。

研究表明，在前列腺癌中Plexin-B1基因突變導(dǎo)致Plexin-B1介導(dǎo)的相關(guān)通路缺失抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲性[12-15]。在前列腺癌中Plexin-B1可以通過(guò)激活癌基因HER-2和c-Met調(diào)節(jié)小GTP酶RhoA、R-Ras和Rap1b與Rac、Rnd和RhoD相互作用，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞的活動(dòng)[16-17]。在晚期前列腺癌中Sema4D/Plexin-B1信號(hào)通路可能通過(guò)激活HER-2和Plexin-B1基因突變，促進(jìn)前列腺癌的侵襲性，該過(guò)程與在乳腺癌中的過(guò)程相似[18-19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Plexin-B1在前列腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常前列腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)前列腺癌組織和良性前列腺組織，結(jié)果表明：Plexin-B1 mRNA在前腺癌組織中的表達(dá)水平高于良性前列腺組織，提示Plexin-B1在前列腺癌中表達(dá)水平出現(xiàn)異常，其可能導(dǎo)致了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析Plexin-B1的表達(dá)和前列腺癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明：Plexin-B1在前列腺癌組織中過(guò)表達(dá)，與臨床分期、WHO/ISUP密切相關(guān)。生存分析結(jié)果表明Plexin-B1高表達(dá)的患者總生存率低于低表達(dá)患者。文獻(xiàn)報(bào)道Plexin-B1可以通過(guò)一系列通路，促進(jìn)PI3K、AKT、ERK/MAPK等分子磷酸化狀態(tài)發(fā)生變化，使前列腺癌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并導(dǎo)致腫瘤的遷徙、侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[20]。在乳腺癌中Plexin-B1可以通過(guò)解離淋巴管間質(zhì)促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散，從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，其機(jī)制還有待于進(jìn)一步分析。

AR信號(hào)通路在前列腺癌中發(fā)揮重要作用，去勢(shì)治療是治療進(jìn)行性前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)療法。而去勢(shì)抵抗前列腺癌對(duì)該療法的抵抗產(chǎn)生了與配體無(wú)關(guān)的AR信號(hào)，其必須進(jìn)入細(xì)胞核作為轉(zhuǎn)錄因子激活基因轉(zhuǎn)錄才能發(fā)揮作用[22]。因此，AR到細(xì)胞核的過(guò)程是潛在治療靶點(diǎn)，成為近年研究熱點(diǎn)。研究表明，多西紫杉醇和強(qiáng)的松治療的去勢(shì)抵抗治療使前列腺癌患者的生存率明顯增加，其與微管蛋白結(jié)合并抑制微管依賴性AR向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)[23]。研究表明Plexin-B1信號(hào)通路可能通過(guò)促進(jìn)AR向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[24]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Plexin-B1和AR的蛋白表達(dá)水平具有相關(guān)性，其相互作用，可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Plexin-B1蛋白作為Sema4D的受體[25]在前列腺癌進(jìn)展中具有重要作用，有望成為新治療靶點(diǎn)。Plexin-B1在前列腺癌中具體生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步分析，可能提高前列腺癌患者的早期診斷效率，有望成為靶向治療的新靶點(diǎn)。