盛仁明,侯 燕,劉加豪,張永勝,涂 健
前列腺癌是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤,早期前列腺癌局限于前列腺內(nèi),預(yù)后較好,若發(fā)生轉(zhuǎn)移較難診治。AR信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)前列腺癌的進(jìn)展至關(guān)重要,去勢(shì)治療是前列腺癌的重要治療手段,而去勢(shì)抵抗性前列腺癌是患者發(fā)生耐藥及死亡的重要原因[1]。Plexin-B1是信號(hào)素Sema4D的跨膜受體[2],其在前列腺癌中通過(guò)Sema4D/Plexin-B1信號(hào)通路激活HER-2以及雄激素受體,促進(jìn)腫瘤的侵襲性[3]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法染色、qRT-PCR法檢測(cè)Plexin-B1 蛋白和mRNA在前列腺癌和良性前列腺組織中的表達(dá),分析其表達(dá)水平與前列腺癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系,為臨床與病理醫(yī)師提供參考。
1.1 臨床資料收集2009年1月~2011年1月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔的82例前列腺癌組織和46例良性前列腺組織,前列腺癌的組織學(xué)類(lèi)型均為腺泡腺癌。82例前列腺癌患者年齡55~94歲,平均72.9歲,>70歲者51例,≤70歲者31例。按照AJCC(2017)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期:Ⅰ+Ⅱ期者35例,Ⅲ+Ⅳ期者47例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例?;颊呔?jīng)手術(shù)切除治療,術(shù)前均未行放、化療或抗雄激素等治療。按WHO/ISIP(2016)分級(jí)分組系統(tǒng)[4]將前列腺癌分為1~5組。82例前列腺癌患者隨訪3~120個(gè)月。
1.2 試劑Plexin-B1兔抗人抗體購(gòu)自Abcam公司,AR的兔抗人多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司。免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋公司。Trizol提取試劑盒購(gòu)自上海宏生生物公司,qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物公司。
1.3 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水,透明,石蠟包埋,3 μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色采用EnVision法,一抗包括Plexin-B1(1 ∶200)、AR(1 ∶300),4 ℃孵育過(guò)夜,具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,用已知陽(yáng)性染色的前列腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照。
Plexin-B1陽(yáng)性結(jié)果判斷參考文獻(xiàn)[5-6]進(jìn)行:(1)按陽(yáng)性細(xì)胞染色程度計(jì)分:不著色或顯色不清為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分,10%~50%為2分,>50%為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘:總分<3分為陰性(-),≥3且<6分為陽(yáng)性(+),≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性()。
1.4 qRT-PCR采用Trizol試劑盒提取20對(duì)前列腺癌和良性前列腺組織的總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用qRT-PCR檢測(cè)Plexin-B1 mRNA基因的表達(dá)。Plexin-B1引物序列:上游5′-GGCGAGGATA CACCAGCAG-3′,下游5′-GTGCAAAGGCACTCACG AA-3′。內(nèi)參β-actin引物序列:上游5′-CACCATTG GCAATGAGCGGTTCC-3′,下游5′-GTAGTTTCGTG GATGCCACAGG-3′。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,合計(jì)40個(gè)循環(huán);進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法繪制生存曲線,配對(duì)資料的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 前列腺癌和良性前列腺組織中Plexin-B1的表達(dá)Plexin-B1陽(yáng)性呈棕黃色或棕褐色顆粒,主要定位于細(xì)胞胞核,胞質(zhì)淺著色,間質(zhì)細(xì)胞未著色。前列腺癌組織中Plexin-B1的陽(yáng)性率為74.39%(61/82)。良性前列腺組織中Plexin-B1的陽(yáng)性率為10.87%(5/46)。前列腺癌組織中Plexin-B1陽(yáng)性率顯著高于良性前列腺組織,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表1,圖1)。
表1 前列腺癌和良性前列腺組織中Plexin-B1的表達(dá)
AB
2.2 前列腺癌組織中Plexin-B1的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系臨床分期Ⅰ+Ⅱ期前列腺癌中Plexin-B1的陽(yáng)性率為61.54%,Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌中Plexin-B1的陽(yáng)性率為86.05%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)。WHO/ISUP(2016)分級(jí)分組中1~5組前列腺癌的Plexin-B1蛋白陽(yáng)性率分別為75.00%、70.00%、60.00%、83.33%、82.35%,5組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005),Plexin-B1蛋白表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、脈管及神經(jīng)有無(wú)侵犯等均無(wú)關(guān)(P>0.05,表2)。
表2 前列腺癌組織中Plexin-B1的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系
2.3 前列腺癌及良性前列腺組織中Plexin-B1 mRNA的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)前列腺癌和良性前列腺組織,結(jié)果顯示:Plexin-B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在前列腺癌中為(267.15±57.06)%,在良性前列腺組織中為(100.00±19.02)%。這提示Plexin-B1 mRNA在前腺癌組織中的表達(dá)水平高于良性前列腺組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.4 Plexin-B1表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,Plexin-B1高表達(dá)組10年生存率為55.74%,Plexin-B1低表達(dá)組10年生存率為85.71%。結(jié)果表明,前列腺癌組織中Plexin-B1高表達(dá)組的生存率低于Plexin-B1低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019,圖2)。
圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析Plexin-B1表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系
2.5 前列腺組織中Plexin-B1與AR表達(dá)的相關(guān)性免疫組化檢測(cè)Plexin-B1和AR在前列腺癌組織中的表達(dá),結(jié)果顯示:Plexin-B1陽(yáng)性組AR陽(yáng)性率為86.89%,Plexin-B1陰性組AR陽(yáng)性率為61.90%。Spearsman等級(jí)相關(guān)分析顯示,Plexin-B1與AR的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.275,P=0.012,表3)。
表3 前列腺癌組織中Plexin-B1和AR表達(dá)的相關(guān)性
脊椎動(dòng)物中Plexin蛋白家族有9個(gè)成員,分成4個(gè)亞組,包括:Plexin-A、Plexin-B、Plexin-C、Plexin-D;其中Plexin-B有3個(gè)成員:Plexin-B1、Plexin-B2和Plexin-B3。Plexin-B1屬于跨膜蛋白分子,其由2 315個(gè)氨基酸組成,mRNA長(zhǎng)7 097 bp,其cDNA長(zhǎng)6 467 bp[7]。研究證實(shí)Plexin-B1在惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌、鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中高表達(dá),并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道,Plexin-B1蛋白作為Sema4D的受體在多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管新生等方面發(fā)揮重要作用[10-11]。目前,Plexin-B1與前列腺癌的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Plexin-B1在前列腺癌細(xì)胞膜、胞質(zhì)和胞核中高表達(dá),尤以細(xì)胞核的表達(dá)水平最高,提示Plexin-B1可能在前列腺癌中起作用。
研究表明,在前列腺癌中Plexin-B1基因突變導(dǎo)致Plexin-B1介導(dǎo)的相關(guān)通路缺失抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲性[12-15]。在前列腺癌中Plexin-B1可以通過(guò)激活癌基因HER-2和c-Met調(diào)節(jié)小GTP酶RhoA、R-Ras和Rap1b與Rac、Rnd和RhoD相互作用,導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞的活動(dòng)[16-17]。在晚期前列腺癌中Sema4D/Plexin-B1信號(hào)通路可能通過(guò)激活HER-2和Plexin-B1基因突變,促進(jìn)前列腺癌的侵襲性,該過(guò)程與在乳腺癌中的過(guò)程相似[18-19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Plexin-B1在前列腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常前列腺組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)前列腺癌組織和良性前列腺組織,結(jié)果表明:Plexin-B1 mRNA在前腺癌組織中的表達(dá)水平高于良性前列腺組織,提示Plexin-B1在前列腺癌中表達(dá)水平出現(xiàn)異常,其可能導(dǎo)致了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。
本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析Plexin-B1的表達(dá)和前列腺癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果表明:Plexin-B1在前列腺癌組織中過(guò)表達(dá),與臨床分期、WHO/ISUP密切相關(guān)。生存分析結(jié)果表明Plexin-B1高表達(dá)的患者總生存率低于低表達(dá)患者。文獻(xiàn)報(bào)道Plexin-B1可以通過(guò)一系列通路,促進(jìn)PI3K、AKT、ERK/MAPK等分子磷酸化狀態(tài)發(fā)生變化,使前列腺癌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并導(dǎo)致腫瘤的遷徙、侵襲能力增強(qiáng),促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[20]。在乳腺癌中Plexin-B1可以通過(guò)解離淋巴管間質(zhì)促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散,從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符,其機(jī)制還有待于進(jìn)一步分析。
AR信號(hào)通路在前列腺癌中發(fā)揮重要作用,去勢(shì)治療是治療進(jìn)行性前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)療法。而去勢(shì)抵抗前列腺癌對(duì)該療法的抵抗產(chǎn)生了與配體無(wú)關(guān)的AR信號(hào),其必須進(jìn)入細(xì)胞核作為轉(zhuǎn)錄因子激活基因轉(zhuǎn)錄才能發(fā)揮作用[22]。因此,AR到細(xì)胞核的過(guò)程是潛在治療靶點(diǎn),成為近年研究熱點(diǎn)。研究表明,多西紫杉醇和強(qiáng)的松治療的去勢(shì)抵抗治療使前列腺癌患者的生存率明顯增加,其與微管蛋白結(jié)合并抑制微管依賴性AR向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)[23]。研究表明Plexin-B1信號(hào)通路可能通過(guò)促進(jìn)AR向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[24]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Plexin-B1和AR的蛋白表達(dá)水平具有相關(guān)性,其相互作用,可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Plexin-B1蛋白作為Sema4D的受體[25]在前列腺癌進(jìn)展中具有重要作用,有望成為新治療靶點(diǎn)。Plexin-B1在前列腺癌中具體生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步分析,可能提高前列腺癌患者的早期診斷效率,有望成為靶向治療的新靶點(diǎn)。