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        淚腺腺樣囊性癌中MYB蛋白表達及分子遺傳學特征分析

        2021-12-23 06:40:54任雨潔楊菁茹李元朋蔡鳳梅夏益敏王卉芳
        臨床與實驗病理學雜志 2021年11期
        關(guān)鍵詞:淚腺易位實性

        劉 輝,任雨潔,楊菁茹,李元朋,蔡鳳梅,夏益敏,王卉芳

        腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是好發(fā)于涎腺的惡性腫瘤[1],淚腺ACC與涎腺ACC相比,臨床更為罕見。淚腺ACC常可侵犯眼眶周圍組織,因眼眶解剖部位的特殊性,手術(shù)常無法完整切除且易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移,患者10年生存率約52%[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)在涎腺ACC中普遍存在MYB、MYBL1和NFIB基因易位[3-7],且MYB蛋白在ACC中過表達,具有較高的敏感性和特異性。既往研究多集中在涎腺ACC,而淚腺ACC報道較少。本文收集16例淚腺ACC和20例淚腺非ACC,采用免疫組化EnVision法和FISH法檢測MYB蛋白表達及MYB基因易位,聯(lián)合MYB蛋白表達和分子遺傳學改變?yōu)闇I腺ACC的診斷提供更多病理學依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料收集2010年9月~2020年9月陜西省西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)手術(shù)切除淚腺ACC標本16例和淚腺非ACC標本20例(包括淚腺混合瘤12例、淚腺惡性混合瘤6例、淚腺腺癌1例、淚腺腺泡細胞癌1例)。所有病例均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療,由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師重新閱片。根據(jù)ACC組織學類型對其進行分級:Ⅰ級以管狀或篩狀結(jié)構(gòu)為主,無實性成分;Ⅱ級為管狀、篩狀和實性成分均有,且實性成分≤30%;Ⅲ級為管狀、篩狀和實性成分均有,且實性成分>30%。收集所有病例的臨床資料,隨訪截至2020年9月,時間為1個月~5年。

        1.2 免疫組化檢測及結(jié)果判定免疫組化采用EnVision法染色,兔單克隆抗體MYB(1 ∶200)購于美國Abcam公司,具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。MYB陽性結(jié)果判讀標準:MYB陽性定位于細胞核,呈棕黃色顆粒。(1)按陽性細胞著色程度計分:未著色為0分,黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;(2)按陽性細胞百分比計分:<10%為0分,10%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分。將兩項評分相乘:0分為陰性,1~4分為弱陽性,5~8分為中等陽性,9~12分為強陽性。

        1.3 FISH檢測及結(jié)果判定FISH檢測MYB基因易位:石蠟包埋組織,4 μm厚連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟水化,晾干。雜交前處理,變性及雜交,探針為MYB(6q23)基因斷裂探針(廣州安必平公司);雜交后洗滌,熒光顯微鏡下觀察切片,4 ℃保存切片等,實驗流程按試劑盒說明書進行。FISH結(jié)果判定:無MYB基因易位的細胞核中顯示2個緊密相鄰的紅、綠信號,或有疊加的部分呈黃色;有MYB基因易位的細胞核則顯示至少1對紅、綠分離信號,且紅、綠信號分離間距≥2個信號點直徑距離。由于切面原因,會出現(xiàn)部分信號丟失現(xiàn)象,因而只計數(shù)信號完整(2紅、2綠)的細胞。選取20個視野(1 000倍),計數(shù)200個細胞核,陽性細胞核比例≥30%時為陽性;<10%時為陰性;≥10%且<30%時為不確定病例,需進行其他驗證。本組未見不確定病例。

        1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用n(%)表示,組間總體分布趨勢比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法,組間兩兩比較采用Bonferrion矯正法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 臨床特征16例ACC患者年齡19~74歲,平均49歲,男女比為5 ∶11,腫瘤最大徑0.8~4.5 cm,平均2.6 cm。淚腺ACC患者臨床表現(xiàn)主要為眼部腫物,部分患者伴眼瞼水腫或疼痛流淚。影像學多表現(xiàn)為明顯的眼眶內(nèi)腫物,部分病例邊界不清,腫瘤組織破壞周圍骨組織呈侵襲性生長,其中2例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨訪時間1個月~5年,4例患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā),隨訪患者均無死亡(表1)。

        表1 淚腺ACC臨床病理資料及免疫組化和FISH檢測

        2.2 病理特征淚腺ACC組織主要由導管細胞和肌上皮細胞構(gòu)成,形成管狀、篩狀或?qū)嵭越Y(jié)構(gòu),篩孔內(nèi)可見嗜堿性黏液樣物質(zhì)(圖1、2),并可見神經(jīng)侵犯(圖3)。按病理學分級:16例淚腺ACC中Ⅰ級5例,以管狀或篩狀結(jié)構(gòu)為主,無實性成分;Ⅱ級9例,有管狀、篩狀和實性成分,且實性成分≤30%;Ⅲ級2例,有管狀、篩狀和實性成分,且實性成分>30%(表1)。部分病例腫瘤細胞也可見條索狀排列。

        2.3 MYB蛋白表達免疫組化EnVision法檢測MYB蛋白在淚腺ACC組織中呈細胞核陽性著色,16例淚腺ACC中強陽性5例(表1,圖4、5),中等陽性11例(圖6)。淚腺ACC中MYB蛋白表達與腫瘤大小、病理分級、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后均無關(guān)(P>0.05)。MYB蛋白在淚腺ACC組和非ACC組中的陽性率分別為100%(16/16)和0(0/20),差異有顯著性(P<0.01)。

        2.4 MYB基因易位FISH法檢測16例淚腺ACC組織中有14例標本存在MYB基因易位(表1),表現(xiàn)為紅綠信號分離(圖7),陽性率為87.5%(14/16)。2例患者FISH檢測陰性,但MYB蛋白免疫組化檢測均呈中等陽性。淚腺ACC中MYB基因易位與腫瘤大小、病理分級、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。20例淚腺非ACC標本中均未檢測到MYB基因易位,差異有顯著性(P<0.01)。

        ①②③④⑤⑥⑦圖1 腫瘤組織呈篩狀排列,腔內(nèi)可見嗜堿性分泌物,可見正常淚腺組織(箭頭) 圖2 淚腺ACC腫瘤細胞呈實性排列圖3 腫瘤細胞呈條索狀排列并侵犯神經(jīng)組織 圖4 MYB在ACC細胞核呈強陽性,EnVision法 圖5 MYB在淚腺ACC組織中呈彌漫強陽性,EnVision法 圖6 MYB在淚腺ACC部分腫瘤細胞呈中等陽性,EnVision法 圖7 FISH檢測淚腺ACC中MYB發(fā)現(xiàn)基因斷裂

        3 討論

        MYB屬于原癌基因,編碼核轉(zhuǎn)錄因子c-MYB,文獻陸續(xù)發(fā)現(xiàn)MYBL1(a-MYB)和MYBL2(b-MYB),三者均為MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員。研究發(fā)現(xiàn)MYB在細胞增殖、分化和血管生成等方面發(fā)揮重要作用[8],c-MYB在白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌和肝癌中均存在過表達。目前,研究顯示ACC常發(fā)生t(6;9)(q22-23;p23-24)染色體易位,MYB和NFIB發(fā)生融合,形成MYB-NFIB融合基因,參與ACC的發(fā)生、發(fā)展[3-7]。WHO(2017)頭頸部腫瘤分類將t(6;9)(q22-23;p23-24)染色體易位作為涎腺ACC特征性的分子遺傳學改變,在涎腺ACC診斷中具有較高的敏感性和特異性。

        ACC多見于涎腺,也可發(fā)生于淚腺、乳腺、肺和皮膚等部位[9-11]。既往研究多集中在涎腺和乳腺等常見部位的ACC,淚腺和肺等少見部位ACC分子改變報道較少[3,11-14]。淚腺ACC常需與淚腺部位其他腫瘤鑒別,特別是淚腺多形性腺瘤、上皮-肌上皮癌和癌在多形性腺瘤等,可利用MYB基因易位在ACC中的高敏感性和特異性進行鑒別診斷。Chen等[12]收集12例淚腺ACC和25例非ACC良性唾液腺組織,在淚腺ACC中MYB基因易位陽性率為58%(7/12),在非ACC組織中并未發(fā)現(xiàn)MYB基因易位。von Holstein等[3]采用分離探針檢測14例淚腺原發(fā)ACC和19例非ACC,結(jié)果發(fā)現(xiàn)7例淚腺ACC存在MYB基因易位,陽性率為50%,非ACC中并未檢測到MYB基因易位。Andreasen等[13]收集64例涎腺、淚腺和乳腺ACC,其中9例淚腺ACC經(jīng)FISH檢測后發(fā)現(xiàn)5例存在MYB-NFIB融合基因。MYB基因易位在淚腺ACC中具有較高的敏感性和特異性,由于其病例數(shù)較少,尚需積累更多病例進一步分析。本組收集16例淚腺ACC,采用MYB斷裂基因進行FISH檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其陽性率為87.5%(14/16),在20例淚腺非ACC中并未檢測MYB易位,與文獻報道一致。

        雖然MYB基因易位在ACC中具有較高的敏感性和特異性,但分子遺傳學檢測MYB陰性的病例并不能完全除外ACC。近年研究顯示ACC中還有其它融合基因[6,11,15-19],同時不同檢測材料和方法也影響檢測結(jié)果。Brill等[14]通過RT-PCR法檢測MYB-NFIB融合基因在頭頸部ACC中的陽性率,在石蠟組織和冷凍組織中的陽性率分別為44%(14/32)和86%(25/29)。Togashi等[16]采用FISH、RT-PCR和RNA Sequence等方法檢測100例ACC,結(jié)果顯示其中73例存在MYB基因易位,24例存在MYBL1基因易位,陽性率為97%(97/100),作者發(fā)現(xiàn)陽性病例表現(xiàn)形式多樣,如果僅使用斷裂探針檢測陽性率僅為87%(87/100),MYB斷裂探針和MYB-NFIB融合探針雙陽性57例,MYB斷裂探針陽性而MYB-NFIB融合探針陰性12例,MYB-NFIB融合探針陽性而MYB斷裂探針陰性3例。此外,還發(fā)現(xiàn)在MYBL1陽性病例中MYBL1斷裂探針和MYBL1-NFIB融合探針雙陽性18例,MYBL1斷裂探針陽性而MYBL1-NFIB融合探針陰性5例,MYBL1斷裂探針陰性而MYBL1-NFIB融合探針陽性2例。Fujii等[19]采用斷裂探針和融合探針檢測33例ACC,其中16例MYB-NFIB、4例MYB-X、2例MYBL1-NFIB、1例MYBL1-X、6例NFIB-X和4例陰性,陽性率為88%(29/33)。Pei等[11]收集7例氣管支氣管部位ACC,并采用RNA Sequence檢測發(fā)現(xiàn)MYB-NFIB、MYBL1-NFIB、MYBL1-RAD51B融合基因。由此可見,雖然MYB在ACC中具有較高的特異性,但仍有MYBL1等其他基因突變,且突變的表現(xiàn)形式多樣,特別是對于MYB基因易位陰性的病例,仍不能完全排除ACC的可能性,需要檢測其他可能存在的基因突變。

        關(guān)于淚腺ACC是否也具有以上各種基因易位情況,由于標本量少,目前僅有少量相關(guān)研究。Andreasen等[13]認為淚腺ACC的基因突變高度集中于MYB和NFIB,而MYBL1則主要發(fā)生于唾液腺ACC中。Togashi等[16]收集4例淚腺ACC,在其中1例中發(fā)現(xiàn)MYBL1斷裂探針陰性而MYBL1-NFIB融合基因陽性。Pei等[11]報道7例氣管支氣管部位ACC中發(fā)現(xiàn)MYBL1-NFIB和MYBL1-RAD51B融合基因。Chen等[12]用MYB斷裂基因FISH法檢測淚腺ACC,作者認為陰性病例仍不能除外ACC可能性。本實驗中用MYB斷裂基因檢測的16例淚腺ACC有14例陽性,2例陰性,但不能完全除外ACC。目前,多數(shù)文獻報道認為MYB的免疫組化法檢測比分子檢測具有更高的敏感性,部分分子檢測陰性的ACC也存在MYB蛋白過表達。本組中2例FISH檢測MYB陰性的病例也出現(xiàn)了MYB蛋白中等陽性,與既往報道一致。也有研究顯示部分非ACC中也出現(xiàn)MYB蛋白的表達[14,20-21]。本組20例淚腺非ACC組織中,并未發(fā)現(xiàn)MYB蛋白強陽性,ACC的診斷仍應(yīng)結(jié)合MYB免疫組化和分子檢測結(jié)果綜合分析。對于ACC分子遺傳學改變與病理分級和臨床特征之間的相關(guān)性,仍存在爭議。Chen等[12]認為淚腺ACC中MYB基因易位與病理特征及患者預(yù)后無關(guān),而Togashi等[16]研究顯示MYB/MYBL1基因易位與病理分級有相關(guān)性。淚腺ACC中的研究因局限于少數(shù)病例,并無大樣本分析,缺乏有力證據(jù)。本實驗有16例患者FISH檢測MYB基因易位結(jié)果,與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、病理學分級和預(yù)后均無相關(guān)性。

        淚腺ACC比涎腺ACC臨床更為少見,但同樣具有特異性的MYB基因易位和MYB蛋白高表達,需聯(lián)合免疫組化和FISH檢測進行診斷。本組淚腺非ACC的惡性腫瘤較少,特別是淚腺腺癌及淚腺腺泡細胞癌均為1例,不能完全除外其他非ACC的淚腺惡性上皮性腫瘤也有MYB蛋白表達或FISH檢測MYB基因易位的可能,需進一步分析。同時,F(xiàn)ISH檢測只采用了斷裂探針,并未同時檢測其他可能存在的融合基因,不能除外其他基因易位的可能性,具有一定局限性。

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