繆小兵，張邢松，陳卓琳，尹海兵

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是常見的惡性淋巴瘤[1]，越來越多的證據(jù)表明，耐藥是治療DLBCL的重要挑戰(zhàn)?，F(xiàn)已證實，腫瘤細胞與纖連蛋白(fibronectin, FN)的黏附可導(dǎo)致耐藥表型，稱為細胞黏附介導(dǎo)的耐藥(cell adhesion mediated-drug resistance, CAM-DR)[2-3]。據(jù)文獻報道，miR-185在調(diào)節(jié)腫瘤耐藥中具有重要作用。miRNA是18～24個核苷酸組成的非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達[4]。Lin等[5]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-185可提高酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)治療無反應(yīng)的慢性粒細胞白血病干細胞/祖細胞對TKI的敏感性。目前，miR-185在DLBCL CAM-DR中的作用尚不清楚。文獻報道，PYK2在腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。PYK2是由PTK2B編碼的非受體酪氨酸激酶，參與感知細胞對細胞外基質(zhì)的黏附。本研究通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)人PTK2B基因的3′非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)含miR-185作用位點，采用慢病毒感染技術(shù)通過抑制或過表達miR-185，分析miR-185對PYK2的調(diào)節(jié)作用，并觀察其對DLBCL CAM-DR的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株人DLBCL細胞OCI-Ly8由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院周曉燕教授惠贈，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。人DLBCL細胞OCI-Ly10及人胚腎HEK-293T細胞購自南京科佰生物公司。OCI-Ly10細胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中；HEK-293T細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2 主要試劑FN購自美國Sigma-Aldrich公司，Phospho-PYK2(Tyr402)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，PYK2抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，GAPDH抗體購自武漢Proteintech公司。Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)及Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 購自美國Jackson Immuno Research Laboratories公司，Trizol試劑購自美國Life Technologies公司，RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。SuperReal PreMix(SYBR Green)試劑盒、miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及miRcute Plus miRNA qPCR試劑盒購自北京天根生物公司。臺盼藍拒染試劑盒購自上海碧云天生物公司。FAK/PYK2激酶抑制劑PF-562271購自上海MedChemExpress公司，Dual-Glo熒光素酶系統(tǒng)購自美國Promega公司。

1.3 細胞黏附細胞培養(yǎng)板預(yù)先用50 μL FN(40 μg/mL)包被過夜，使用PBS洗滌2次，將DLBCL細胞輕輕重懸于無血清培養(yǎng)基中。隨后將細胞接種于96孔板(每孔5×104個細胞)中，并在37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。無血清培養(yǎng)基洗滌3次去除未黏附細胞。

1.4 慢病毒感染miR-185上調(diào)/下調(diào)慢病毒及PYK2過表達慢病毒購自上海吉凱基因公司，慢病毒感染嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.5 qPCR檢測PTK2B mRNA分析：Trizol試劑分離總RNA后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將分離的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SuperReal PreMix(SYBR Green)試劑盒進行擴增。miR-185分析：利用miRcute miRNA分離試劑盒分離RNA后，使用miRcute miRNA cDNA試劑盒將分離的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用miRcute miRNA qPCR試劑盒進行擴增。PTK2B引物序列：正向5′-GTCAGCCATGTTCTCAGCCT-3′；反向5′-ACTAGT CAGGACGCAAAGCC-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；反向5′-CACCCT GTTGCTGTAGCCAAA-3′；miR-185引物序列：正向5′-ACACTCCAGCTGGGTGGAGAGAAAGGCAGT-3′；反向5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6引物序列：正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′；反向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.6 Western blot法收集細胞裂解后進行SDS-PAGE凝膠電泳實驗，PVDF膜轉(zhuǎn)印后用含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h。一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，二抗室溫孵育2 h，PBST洗滌3次后ECL液顯影。Phospho-PYK2(Tyr402)按1 ∶1 000比例稀釋；PYK2按1 ∶500比例稀釋；GAPDH按1 ∶5 000比例稀釋；Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)及Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 均為1 ∶10 000比例稀釋。

1.7 熒光素酶報告基因檢測利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-185與PTK2B的結(jié)合位點，將PTK2B 3′ UTR上的miR-185潛在結(jié)合位點克隆至GV272(SV40-firefly_Luciferase-MCS)載體中，構(gòu)建野生型PTK2B 3′ UTR熒光素酶報告載體；將結(jié)合位點進行突變，構(gòu)建結(jié)合位點突變型PTK2B 3′ UTR熒光素酶報告載體。將構(gòu)建的3′ UTR載體與miR-185 mimics、Renilla 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞使用Dual-Glo熒光素酶系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。

1.8 臺盼藍拒染實驗收集處理的細胞，用PBS洗滌2次，重懸于PBS中，將10 μL細胞懸液與10 μL 0.4%臺盼藍溶液混合1 min。使用血球計數(shù)板計數(shù)活細胞以及死亡細胞數(shù)目(死亡細胞被染成淡藍色，活細胞為無色透明狀)，細胞死亡比例(%)=死亡細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死亡細胞總數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL細胞與FN黏附對miR-185及PYK2表達的影響采用qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，OCI-Ly8與FN黏附培養(yǎng)組、懸浮培養(yǎng)組中miR-185的表達：(0.17±0.07)vs(1.01±0.11)(t=9.05，P<0.001)；OCI-Ly10細胞與FN黏附培養(yǎng)組、懸浮培養(yǎng)組中miR-185表達：(0.35±0.15)vs(1.01±0.15)(t=4.50，P=0.011)；提示OCI-Ly8及OCI-Ly10細胞與FN黏附培養(yǎng)可下調(diào)miR-185表達(圖1A)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，OCI-Ly8及OCI-Ly10細胞與FN黏附培養(yǎng)可上調(diào)PYK2總蛋白及pPYK2(Tyr402)表達水平(圖1B)。

圖1 A. qPCR檢測懸浮及黏附培養(yǎng)狀態(tài)下miR-185的表達，*P<0.05，***P<0.001；B. Western blot法檢測懸浮及黏附培養(yǎng)狀態(tài)下PYK2總蛋白及pPYK2(Tyr402)的表達

2.2 miR-185對PYK2表達的影響Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，在懸浮及FN黏附培養(yǎng)狀態(tài)下，敲低miR-185可上調(diào)PYK2總蛋白及pPYK2(Tyr402)表達水平(圖2A、B)。OCI-Ly8細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)Ctrl組與miR-185組中PTK2B mRNA的表達：(1.01±0.21)vs(0.95±0.36)(t=0.24，P=0.819)；OCI-Ly8細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)Ctrl組與miR-185組中PTK2B mRNA的表達：(1.33±0.10)vs(1.36±0.21)(t=0.23，P=0.833，圖2C)。OCI-Ly10細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)Ctrl組與miR-185組中PTK2B mRNA的表達：(1.01±0.19)vs(0.98±0.16)(t=0.21，P=0.844)；OCI-Ly10細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)Ctrl組與miR-185組中PTK2B mRNA的表達：(1.31±0.10)vs(1.20±0.21)(t=0.79，P=0.472，圖2D)；提示過表達miR-185并不顯著影響懸浮及FN黏附培養(yǎng)狀態(tài)下PTK2B mRNA的表達水平。在HEK-293T細胞中過表達miR-185后，3′UTR空載體組與野生型PTK2B 3′UTR組的相對熒光素酶報告基因活性：(1.00±0.06)vs(0.49±0.04)(t=9.54，P<0.001)；3′UTR空載體組與突變型PTK2B 3′UTR組的相對熒光素酶報告基因活性：(1.00±0.06)vs(0.94±0.06)(t=1.01，P=0.371)；野生型PTK2B 3′UTR組與突變型PTK2B 3′UTR組的相對熒光素酶報告基因活性：(0.49±0.04)vs(0.94±0.06)(t=8.65，P<0.001)；提示過表達miR-185可降低野生型PTK2B 3′UTR熒光素酶報告基因活性，但并不顯著影響突變型PTK2B 3′UTR熒光素酶報告基因活性(圖2E)。上述結(jié)果表明miR-185可靶向調(diào)節(jié)PYK2。

圖2 miR-185對PYK2表達的影響：A. Western blot法檢測OCI-Ly8細胞中PYK2總蛋白及pPYK2(Tyr402)表達水平：shCtrl.對照慢病毒；sh-miR-185.miR-185下調(diào)慢病毒； B. Western blot檢測OCI-Ly10細胞中PYK2總蛋白及pPYK2(Tyr402)表達水平：shCtrl.對照慢病毒；sh-miR-185.miR-185下調(diào)慢病毒；C. qPCR檢測OCI-Ly8細胞中PTK2B mRNA表達水平：Ctrl.對照慢病毒；miR-185.miR-185上調(diào)慢病毒；D. qPCR檢測OCI-Ly10細胞中PTK2B mRNA表達水平：Ctrl.對照慢病毒；miR-185.miR-185上調(diào)慢病毒；E.熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治鰉iR-185對PTK2B 3′UTR活性的影響：空載體. 3′UTR空載質(zhì)粒；野生型.野生型PTK2B 3′UTR報告基因質(zhì)粒；突變型.突變型PTK2B 3′UTR報告基因質(zhì)粒，***P<0.001，#P>0.05

2.3 miR-185、PYK2對DLBCL細胞CAM-DR的影響臺盼藍拒染實驗顯示，OCI-Ly8細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下shCtrl+Doxo(多柔比星)組與sh-miR-185+Doxo組細胞死亡比例：(76.33±12.08)%vs(41.40±14.05)%(t=3.27，P=0.031)。OCI-Ly10細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下shCtrl+Doxo組與sh-miR-185+Doxo組細胞死亡比例：(69.90±6.61)%vs(43.77±8.19)%(t=4.30，P=0.013)。OCI-Ly8細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)下shCtrl+Doxo組與sh-miR-185+Doxo組細胞死亡比例：(39.43±3.94)%vs(26.93±6.25)%(t=2.93，P=0.043)。OCI-Ly10細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)下shCtrl+Doxo組與sh-miR-185+Doxo組細胞死亡比例：(43.67±9.66)%vs(16.10±3.42)%(t=4.66，P=0.009，)。結(jié)果顯示，在OCI-Ly8及OCI-Ly10細胞中敲低miR-185可抑制懸浮及黏附培養(yǎng)狀態(tài)下Doxo誘導(dǎo)的細胞死亡(圖3A、B)。OCI-Ly8細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Ctrl+Doxo組與PYK2+Doxo組細胞死亡比例：(58.73±8.55)%vs(39.97±3.19)%(t=3.56，P=0.024)。OCI-Ly10細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下Ctrl+Doxo組與PYK2+Doxo組細胞死亡比例：(59.33±8.73)%vs(33.30±6.50)%(t=4.14，P=0.014)。OCI-Ly8細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)下Ctrl+Doxo組與PYK2+Doxo組細胞死亡比例：(37.70±7.64)%vs(20.07±7.59)%(t=2.84，P=0.047)。OCI-Ly10細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)下Ctrl+Doxo組與PYK2+Doxo組細胞死亡比例：(34.00±5.46)%vs(14.37±3.46)%(t=5.26，P=0.006)。結(jié)果顯示，過表達PYK2可抑制懸浮及黏附培養(yǎng)狀態(tài)下Doxo誘導(dǎo)的細胞死亡(圖3C、D)。上述結(jié)果表明，細胞黏附介導(dǎo)的miR-185下調(diào)和PYK2表達增加，可促進CAM-DR。

圖3 miR-185、PYK2對DLBCL細胞CAM-DR的影響：A.臺盼藍拒染實驗檢測敲低miR-185對OCI-Ly8細胞CAM-DR的影響：shCtrl.對照慢病毒；sh-miR-185.miR-185下調(diào)慢病毒；shCtrl+Doxo.對照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；sh-miR-185+Doxo.miR-185下調(diào)慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；B.臺盼藍拒染實驗檢測敲低miR-185對OCI-Ly10細胞CAM-DR的影響：shCtrl.對照慢病毒；sh-miR-185.miR-185下調(diào)慢病毒；shCtrl+Doxo.對照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；sh-miR-185+Doxo.miR-185下調(diào)慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；C.臺盼藍拒染實驗檢測過表達PYK2對OCI-Ly8細胞CAM-DR的影響：Ctrl.對照慢病毒；PYK2. PYK2過表達慢病毒；Ctrl+Doxo.對照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；PYK2+Doxo.PYK2過表達慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；D.臺盼藍拒染實驗檢測過表達PYK2對OCI-Ly10細胞CAM-DR的影響：Ctrl.對照慢病毒；PYK2. PYK2過表達慢病毒；Ctrl+Doxo.對照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；PYK2+Doxo.PYK2過表達慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；*P<0.05，**P<0.01

2.4 PF-562271對DLBCL細胞CAM-DR的影響臺盼藍拒染實驗顯示，OCI-Ly8細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下shCtrl+Doxo組與sh-miR-185+Doxo組細胞死亡比例：(54.03±5.21)%vs(40.33±3.15)%(t=3.90，P=0.018)；OCI-Ly10細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下shCtrl+Doxo組與sh-miR-185+Doxo組細胞死亡比例：(60.87±6.26)%vs(39.70±5.12)%(t=4.53，P=0.011)。OCI-Ly8細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下sh-miR-185+Doxo組與sh-miR-185+Doxo+PF-562271組細胞死亡比例：(40.33±3.15)%vs(58.13±5.59)%(t=4.81，P=0.009)；OCI-Ly10細胞懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下sh-miR-185+Doxo組與sh-miR-185+Doxo+PF-562271組細胞死亡比例：(39.70±5.12)%vs(55.07±7.43)%(t=2.95，P=0.042)。OCI-Ly8細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)下shCtrl+Doxo組與sh-miR-185+Doxo組細胞死亡比例：(34.37±3.72)%vs(25.03±3.30)%(t=3.25，P=0.031)；OCI-Ly10細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)下shCtrl+Doxo組與sh-miR-185+Doxo組細胞死亡比例：(40.50±3.63)%vs(27.50±6.52)%(t=3.02，P=0.039)。OCI-Ly8細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)下sh-miR-185+Doxo組與sh-miR-185+Doxo+PF-562271組細胞死亡比例：(25.03±3.30)%vs(39.37±5.06)%(t=4.11，P=0.015)；OCI-Ly10細胞黏附培養(yǎng)狀態(tài)下sh-miR-185+Doxo組與sh-miR-185+Doxo+PF-562271組細胞死亡比例：(27.50±6.52)%vs(47.53±9.43)%(t=3.03，P=0.039)。結(jié)果顯示，F(xiàn)AK/PYK2雙重抑制劑PF-562271可顯著增加懸浮及黏附培養(yǎng)狀態(tài)下Doxo誘導(dǎo)的細胞死亡(圖4A、B)。上述研究結(jié)果提示PF-562271可抑制miR-185下調(diào)介導(dǎo)的CAM-DR表型。在DLBCL中miR-185下調(diào)，可能通過介導(dǎo)PYK2 表達增加來促進CAM-DR。

圖4 臺盼藍拒染實驗檢測PF-562271對DLBCL細胞CAM-DR的影響：A.OCI-Ly8細胞；B. OCI-Ly10細胞；shCtrl+Doxo.對照慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；sh-miR-185+Doxo.miR-185下調(diào)慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星；sh-miR-185+Doxo+PF-562271.miR-185下調(diào)慢病毒+1.0 μmol/L多柔比星+4.0 μmol/L PF-562271；*P<0.05，**P<0.01

3 討論

miR-185表達異常與多種造血和非造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Ni等[8]報道，miR-185在膠質(zhì)瘤中下調(diào)，敲低miR-185可增強U251和U87細胞的遷移能力，并顯著抑制細胞凋亡。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-185在結(jié)直腸癌中的表達低于正常腸黏膜組織；miR-185低表達與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。 miR-185可通過靶向樹突狀細胞特異C型凝集素DC-SIGN降低MMP-9和VEGF的表達。miR-185/DC-SIGN通過使PI3K/Akt/GSK-3β信號通路失活抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位[9]。Afshar等[10]報道，上調(diào)miR-185的表達可增強結(jié)直腸癌細胞的放療敏感性。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-185可抑制A549和H460肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并促進腫瘤細胞凋亡。在肺鱗癌H520細胞中，過表達miR-185可以部分逆轉(zhuǎn)lncRNA PART1(prostate androgen regulated transcript 1)對細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡影響[12]?，F(xiàn)已證實，miR-185在調(diào)節(jié)腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用。過表達miR-185可增強胃癌細胞對低劑量化療藥物的敏感性；而敲低miR-185可降低大劑量化療誘導(dǎo)的細胞凋亡[13]。最新一項研究報道，在TKI治療無反應(yīng)的慢性粒細胞白血病干細胞/祖細胞中過表達miR-185可以下調(diào)PAK6的表達，進而抑制細胞存活并增強TKI的敏感性[5]。本組結(jié)果顯示，與懸浮培養(yǎng)相比，OCI-Ly8及OCI-Ly10細胞與FN黏附培養(yǎng)可顯著下調(diào)miR-185的表達水平，細胞黏附介導(dǎo)的miR-185下調(diào)可促進CAM-DR。

PYK2屬于FAK激酶家族，在調(diào)控細胞生長、存活、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[14]。文獻報道，PYK2在多種腫瘤如乳腺癌、肝細胞癌、肺癌、白血病、結(jié)腸癌、卵巢癌中表達增加[15]。PYK2表達異常與多種腫瘤的增殖相關(guān)，如三陰型乳腺癌[16]、多發(fā)性骨髓瘤[6]、小細胞肺癌[17]。有研究報道，PYK2在調(diào)控腫瘤耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Verma等[16]報道，在三陰型乳腺癌中，敲低PYK2可通過抑制HER-3上調(diào)，繼而抑制HER-3相關(guān)耐藥。Meads等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在多發(fā)性骨髓瘤中腫瘤細胞與FN黏附可引起PYK2磷酸化，繼而促進STAT3磷酸化；在骨髓微環(huán)境中，靶向PYK2可誘導(dǎo)腫瘤細胞的死亡，并抑制腫瘤細胞的生長。本組實驗發(fā)現(xiàn)，OCI-Ly8及OCI-Ly10細胞與FN黏附可上調(diào)PYK2總蛋白及pPYK2(Tyr402)表達水平。PYK2上調(diào)可促進CAM-DR。此外，實驗還發(fā)現(xiàn)PF-562271可顯著增加懸浮及黏附培養(yǎng)狀態(tài)下Doxo誘導(dǎo)的OCI-Ly8和OCI-Ly10細胞死亡，抑制miR-185下調(diào)介導(dǎo)的CAM-DR表型。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)DLBCL細胞與FN黏附培養(yǎng)可下調(diào)miR-185表達，并上調(diào)PYK2總蛋白及pPYK2(Tyr402)表達水平。在DLBCL中miR-185可靶向抑制PYK2，細胞黏附介導(dǎo)的miR-185下調(diào)，可能通過誘導(dǎo)PYK2表達增加促進CAM-DR。FAK/PYK2雙重抑制劑PF-562271，可抑制miR-185下調(diào)介導(dǎo)的CAM-DR表型。本實驗僅通過體外實驗初步分析miR-185和PYK2在DLBCL CAM-DR中的作用，體內(nèi)實驗中兩者是否影響DLBCL耐藥仍有待進一步驗證。因此，深入探討miR-185和PYK2在DLBCL中的作用及分子機制，可為后續(xù)逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥的研究提供實驗數(shù)據(jù)。