吉佳樂(lè)，林 爽，曾 暉，姚馨悅，李 楊，何志承

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)是一種由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引發(fā)的強(qiáng)傳染性疾病，其通過(guò)呼吸道飛沫、氣溶膠及攜帶病毒的分泌物進(jìn)行傳播。此外，無(wú)癥狀感染者也可能成為傳染源，給全球尤其是老人、有基礎(chǔ)性疾病的患者帶來(lái)了嚴(yán)重的健康危機(jī)。因此，該病的防控和治療至關(guān)重要。患者在感染COVID-19后期，部分組織器官可能會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的生理變化和病理學(xué)癥狀[1]。姚小紅等[2]研究表明：COVID-19病變主要以肺部病變最明顯，免疫組化提示肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均存在COVID-19抗原表達(dá)，其還對(duì)腎臟、肝臟、心血管等其他臟器也有影響。免疫組化是病理診斷的重要輔助手段，可以幫助病理醫(yī)師在診斷過(guò)程中明確組織中抗原的表達(dá)位置及陽(yáng)性細(xì)胞比例，并對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究[3]。因此，免疫組化在臨床病理診斷中不可替代，在COVID-19病理尸檢工作中也發(fā)揮重要作用。由于Nucleocapsid是COVID-19新研發(fā)抗體，暫無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，試劑盒說(shuō)明書(shū)建議Western blot實(shí)驗(yàn)中一抗稀釋濃度為1 ∶1 000～1 ∶5 000；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中一抗稀釋濃度為1 ∶5 000～1 ∶10 000；但對(duì)免疫組化的稀釋濃度及孵育條件無(wú)明確建議。本文現(xiàn)收集8例COVID-19尸檢肺組織標(biāo)本，分別使用全自動(dòng)免疫組化染色儀和手工免疫組化進(jìn)行染色，探討其在不同操作條件下的免疫組化染色情況，以便得到定位準(zhǔn)確、背景清晰的染色切片，更好地為COVID-19的病理診斷和臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年3～6月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科8例COVID-19尸檢石蠟包埋組織，以2.5 μm厚連續(xù)切片15張，85 ℃烤片30 min備用[4]。將COVID-19的Nucleocapsid抗體，分別按1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000的比例進(jìn)行稀釋備用。

1.2 主要試劑及儀器COVID-19的Nucleocapsid(40143-R019)抗體，購(gòu)自北京義翹神州公司。EDTA修復(fù)液和檸檬酸修復(fù)液(MVS-0100)，均購(gòu)自福州邁新公司。OptiView DAB IHC Detection Kit和Roche BenchMark全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Ventana公司。

1.3 HE染色及免疫組化

1.3.1HE染色 將備好的組織切片進(jìn)行HE染色，具體流程如下：將切片脫蠟、脫水，蘇木精染色 5 min，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，1%氨水返藍(lán) 2 min，水洗后再用伊紅染色 1 min，切片經(jīng)脫水、透明、封固，光鏡下觀(guān)察。

1.3.2全自動(dòng)免疫組化儀染色 將備好的組織切片放入Roche BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀中，設(shè)定相應(yīng)程序進(jìn)行染色。程序設(shè)定如下：75 ℃條件下烤片4 min；EZ Prep溶液76 ℃脫蠟4 min；Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修復(fù)液99 ℃修復(fù)36 min；抑制劑孵育45 min；加入一抗100 μL，36 ℃孵育32 min；Reaction Buffer Concentrate(10×)緩沖液清洗5 min；二抗37 ℃孵育8 min；DAB顯色8 min，蘇木精I(xiàn)I襯染12 min，返藍(lán)液返藍(lán)4 min，脫水、透明、封固。

1.3.3手工免疫組化染色 組織切片經(jīng)二甲苯-二甲苯-100%乙醇-100%乙醇-95%乙醇-75%乙醇常規(guī)脫蠟、水化、蒸餾水浸泡。采用高溫高壓修復(fù)，用檸檬酸(或EDTA)修復(fù)液修復(fù)2.5 min。自然冷卻后置于3%H2O2中，37 ℃ 10 min，PBS沖洗3 min×3次。加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜(或37 ℃孵育1 h )，PBS沖洗3 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染3 min，酸化后返藍(lán)、脫水、透明、封固。

1.4 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測(cè)將標(biāo)本制備成厚度為100 nm的超薄切片，染色后用透射電子顯微鏡(日立HT7700，電壓 100 kV)觀(guān)察超微結(jié)構(gòu)變化。提取的檢測(cè)標(biāo)本RNA用RT-PCR試劑盒(8.0131901X024E，廈門(mén)艾德生物公司)進(jìn)行核酸檢測(cè)。透射電鏡掃描、核酸檢測(cè)與免疫組化檢測(cè)，均來(lái)自同一例尸檢的肺組織標(biāo)本。

2 結(jié)果

2.1 HE染色HE染色結(jié)果清晰可見(jiàn)肺泡上皮稍增生，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)分泌物及出血，肺泡間隔增寬，纖維組織增生并見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。

2.2 全自動(dòng)免疫組化染色儀最佳染色條件本科室采用Roch BenchMark全自動(dòng)免疫組化染色平臺(tái)，設(shè)置不同一抗?jié)舛葹? ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000和陰性對(duì)照的4個(gè)組別。結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組的組織待檢細(xì)胞無(wú)陽(yáng)性信號(hào)(圖1B)，提示COVID-19的Nucleocapsid抗體表達(dá)有特異性。在不同濃度的一抗中發(fā)現(xiàn)COVID-19的Nucleocapsid 抗體在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞均呈陽(yáng)性。其中，稀釋比為1 ∶2 000(圖1C)和1 ∶4 000(圖1D)組的非特異性著色較為明顯，稀釋比為1 ∶8 000組陽(yáng)性細(xì)胞染色更加清晰，特異性較高(圖1E)；高倍鏡下視野可清晰觀(guān)察到肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞呈陽(yáng)性(圖1F)。以上結(jié)果提示：全自動(dòng)免疫組化染色儀檢測(cè)COVID-19的Nucleocapsid抗體，按稀釋比為1 ∶8 000可取得較好的染色效果。

ABCDEF

2.3 手工免疫組化最佳染色條件在進(jìn)行手工免疫組化染色時(shí)，本組分別設(shè)置了不同的抗原修復(fù)條件、抗體孵育方式及一抗?jié)舛?。結(jié)果顯示采用EDTA對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)后，陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度明顯高于檸檬酸修復(fù)，但其特異性較差，陽(yáng)性著色部位不夠明確。進(jìn)一步通過(guò)不同方式進(jìn)行一抗孵育，結(jié)果顯示一抗4 ℃孵育過(guò)夜的染色效果優(yōu)于37 ℃孵育1 h，其非特異性著色相對(duì)較少。在不同一抗?jié)舛炔町惙治鲋邪l(fā)現(xiàn)，組織非特異性著色隨著一抗稀釋比的增加而逐漸降低，但是一抗1 ∶8 000稀釋濃度未見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)。因此，推薦采用1 ∶4 000的一抗稀釋濃度。此外，陰性對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性信號(hào)。根據(jù)不同染色條件結(jié)果顯示：手工免疫組化染色檢測(cè)COVID-19的Nucleocapsid抗體時(shí)，最佳染色條件為檸檬酸修復(fù)、一抗4 ℃過(guò)夜孵育、一抗稀釋比為1 ∶4 000(圖2)。

ABCDEFGH

2.4 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測(cè)將8例COVID-19尸檢組織分別使用電鏡掃描和核酸檢測(cè)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)病毒顆粒和PCR檢測(cè)病毒陽(yáng)性(圖3)，提示待檢樣本染色陽(yáng)性的可靠性。

圖3 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測(cè)：A.透射電鏡掃描顯示肺組織內(nèi)有病毒顆粒；B.COVID-19核酸檢測(cè)為COVID-19陽(yáng)性；紅色是HEX通道，顯示內(nèi)參基因；藍(lán)色是ROX通道，顯示COVID-19開(kāi)放閱讀框1 ab基因的保守區(qū)域；綠色是FAM通道，顯示COVID-19衣殼蛋白基因的保守區(qū)域

3 討論

COVID-19具有高度傳染性，其周期性大暴發(fā)及國(guó)際性傳播對(duì)全球的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)發(fā)展構(gòu)成重大的威脅，有效的防控和治療至關(guān)重要。Bian等[5]研究發(fā)現(xiàn)：患者感染SARS-CoV-2后，將導(dǎo)致多處器官和組織受損傷，并伴明顯的肺部病變。Yao等[6]通過(guò)電鏡在肺Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)直徑為70～100 nm的新型冠狀病毒顆粒，肺部組織切片經(jīng)免疫組化染色后也證實(shí)在肺組織中存在SARS-CoV-2病毒。免疫組化是指利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(如熒光素、酶、金屬離子和同位素)顯色，以確定組織細(xì)胞內(nèi)的抗原，并對(duì)其進(jìn)行定位、定性及半定量的研究[7]。高質(zhì)量的免疫組化染色效果更有利于結(jié)果的判讀，對(duì)推進(jìn)COVID-19病理機(jī)制的研究具有重要意義。免疫組化染色過(guò)程中的切片制備、抗原修復(fù)、抗體濃度及孵育條件、顯色等各個(gè)環(huán)節(jié)均可能影響最終的結(jié)果，故探索其最優(yōu)染色條件至關(guān)重要。

研究報(bào)道[8]，由于COVID-19標(biāo)本的特殊性，固定時(shí)間以48 h最佳，病毒標(biāo)本必須間隔1 cm切開(kāi)，并使用5～10倍固定液充分固定后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外，在切片制備過(guò)程中，要根據(jù)標(biāo)本的類(lèi)型選擇合適的厚度。本組選用的是肺組織標(biāo)本，切片過(guò)薄容易丟失部分抗原信號(hào)，過(guò)厚容易出現(xiàn)細(xì)胞堆積導(dǎo)致染色過(guò)深影響判讀，且在高溫高壓抗原修復(fù)時(shí)容易掉片，故應(yīng)選擇適宜的厚度(3 μm)進(jìn)行切片?？酒瑫r(shí)溫度不高于70 ℃，同時(shí)保持切片干燥，有利于組織和撥片充分粘合。由于前期經(jīng)10%中性福爾馬林固定形成醛鍵，遮蔽抗原決定簇，干擾抗原與抗體的特異性結(jié)合，行免疫組化染色時(shí)需進(jìn)行抗原修復(fù)，使抗原決定簇充分暴露[9]；但修復(fù)方式和修復(fù)液選擇不當(dāng)，均可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。劉智等[10]研究證實(shí)，高溫高壓修復(fù)優(yōu)于微波抗原修復(fù)，而檸檬酸(pH 6.0)和EDTA(pH 9.0)兩種不同修復(fù)液也會(huì)影響免疫組化染色結(jié)果。因此，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)COVID-19的Nucleocapsid抗體最佳修復(fù)方式進(jìn)行摸索。為去除細(xì)胞中殘留的雜蛋白、內(nèi)源性酶等，常使用過(guò)氧化物酶封閉液破壞酶活性，避免非特異性著色[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：相同修復(fù)條件下使用同濃度抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，全自動(dòng)免疫組化染色儀的染色效果優(yōu)于手工免疫組化，特異性著色也相對(duì)較少，原因可能是Roche BenchMark全自動(dòng)染色儀采用噴射式清洗技術(shù)，可均勻徹底的清洗切片，使染色背景更干凈，染色結(jié)果更為清晰。此外，抗原抗體特異性結(jié)合達(dá)到平衡終點(diǎn)需要一定的溫度、時(shí)間和濃度，故探討抗體的孵育時(shí)間、溫度和一抗?jié)舛纫仓陵P(guān)重要。研究證明[12]：陽(yáng)性細(xì)胞強(qiáng)度隨一抗孵育溫度升高而增強(qiáng)，但陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與孵育溫度無(wú)直接關(guān)系，溫度過(guò)高反而會(huì)降低抗原抗體結(jié)合效率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一抗4 ℃過(guò)夜孵育的染色質(zhì)量?jī)?yōu)于37 ℃ 孵育1 h的染色質(zhì)量，其染色清晰、著色均勻、特異性更高，提示手工免疫組化染色經(jīng)4 ℃孵育更有利于抗原抗體的有效結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)全自動(dòng)免疫組化染色儀和手工免疫組化染色的抗體特異性，均隨著一抗?jié)舛鹊脑黾佣档?，兩者最佳染色濃度分別為1 ∶8 000和1 ∶4 000，提示抗原抗體結(jié)合不僅受外界環(huán)境的影響，而且與抗體自身的濃度也顯著相關(guān)，濃度太高或太低，都會(huì)影響抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)。除一抗?jié)舛韧?，二抗的稀釋比例和顯色時(shí)間對(duì)染色結(jié)果也至關(guān)重要，二抗?jié)舛冗^(guò)高或顯示時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，均會(huì)出現(xiàn)著色較深、非特異性著色增加的現(xiàn)象。因此，對(duì)于新抗體一定要摸索出最佳染色條件后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以得到更為優(yōu)化、準(zhǔn)確的結(jié)果。

隨著越來(lái)越多新型抗體的出現(xiàn)，免疫組化染色結(jié)果在病理診斷、預(yù)后判斷、指導(dǎo)治療等方面發(fā)揮重要作用。在全球COVID-19暴發(fā)的特殊時(shí)期，準(zhǔn)確的組織病理學(xué)診斷結(jié)果將有助于學(xué)者對(duì)該病毒感染機(jī)制的進(jìn)一步分析，為后期疫苗和臨床治療藥物的研發(fā)、診治方案優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。因此，制作一張高質(zhì)量的免疫組化染色切片也將為COVID-19的研究和臨床診斷治療提供必要的參考。