姜樹(shù)忠
(遼寧省森林經(jīng)營(yíng)研究所,遼寧 丹東 118002)
白樺Betulaplatyphylla又稱為臭樺、樺木,為樺木科Betulaceae樺木屬Betula植物[1]。白樺分布廣泛,北至俄羅斯遠(yuǎn)東及東西伯利亞地區(qū),南至我國(guó)云南,東至日本和朝鮮,西至新疆和西藏太昭,在我國(guó)白樺主要分布在東北大小興安嶺、長(zhǎng)白山、完達(dá)山等地區(qū)[2-6]。白樺是重要的落葉喬木樹(shù)種,適應(yīng)性強(qiáng),抗寒、喜光、喜酸性土壤、耐貧瘠,天然更新快,生長(zhǎng)快,常為采伐跡地和火燒跡地的先鋒樹(shù)種[7-11]。白樺具有重要的生態(tài)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。白樺木材光滑潔白,紋理細(xì)致,常為家具、礦柱、枕木、工藝品、造紙業(yè)、餐飲業(yè)等提供原料,大徑級(jí)白樺還是重要的航空膠合板原料,樹(shù)皮可做栲膠,汁液可做飲料[12-17]。白樺樹(shù)皮組成成分復(fù)雜,藥理活性多樣,樹(shù)皮中含有白樺脂酸、齊墩果酸和白樺脂醇等三萜類化合物[18],此類物質(zhì)具有重要的藥用價(jià)值,據(jù)《本草綱目》中記載,白樺樹(shù)皮可用于治療疥瘡、黃疸、乳癰等疾病[19-21]。從20世紀(jì)初,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,三萜物質(zhì)在消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、降血脂、清熱利濕等方面效果顯著[22-24]。經(jīng)過(guò)大量研究,科研人員發(fā)現(xiàn)三萜化合物中的白樺脂酸作為生物抑制劑在對(duì)抗癌細(xì)胞和HIV病毒時(shí)還具有高效低毒的特點(diǎn)[25-26],因此三萜類化合物在醫(yī)藥研究中有巨大潛力,值得深入研究。
三萜類化合物目前通過(guò)生物提取和人工合成的方式獲得,現(xiàn)在主要以生物提取為主。目前研究中,三萜化合物的提取、分離和檢測(cè)方式眾多,效率也不同。三萜化合物因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)復(fù)雜,極性相似,不易分離提純,而應(yīng)用中需求量大,要求純度較高。三萜化合物雖然廣泛存在于自然界大多數(shù)植物中,但含量極低。目前研究發(fā)現(xiàn),植物中白樺的三萜化合物含量相對(duì)較高,有利于提取。人工化學(xué)合成方式理論上可行,但是三萜類化合物結(jié)構(gòu)太過(guò)復(fù)雜,目前還未完全弄清三萜化合物合成具體方式,化學(xué)合成效率低,成本高[27],無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。由此可見(jiàn)改進(jìn)提取方式、提升原料含量和人工合成都急需進(jìn)一步研究,達(dá)到提高三萜化合物生產(chǎn)效率的目的,從而提高三萜化合物在醫(yī)藥研究和其他相關(guān)的科學(xué)研究中的原料應(yīng)用保障。
白樺三萜(Triterpenes ofBetulaplatyphylla,TBP)主要包括白樺脂醇(Betulin,C30H50O2)、白樺脂酸(Betulinic acid,C30H48O3)[28]和齊墩果酸(Oleanolic acid,C30H48O3)等化合物。白樺脂醇和白樺脂酸都屬于羽扇豆烷型的五環(huán)三萜類化合物,齊墩果酸屬于齊墩果烷型的五環(huán)三萜類化合物,都是十分重要的天然次生代謝產(chǎn)物,廣泛分布于各種植物中,且白樺中的三萜化合物含量普遍高于其他植物,因此白樺是白樺三萜的主要提取原料。
白樺脂醇別名樺木醇和樺木腦,于1788年被Lowit在白樺中發(fā)現(xiàn)和分離出來(lái),1952年才被最終確定化學(xué)結(jié)構(gòu)。白樺脂醇溶于乙醇、苯、乙醚和氯仿等溶劑,微溶于水。白樺脂醇在白樺樹(shù)皮中含量最高,為樹(shù)皮干重的10%~34%[29],白樺的種源類型、樹(shù)齡和生長(zhǎng)環(huán)境都對(duì)白樺脂醇含量產(chǎn)生顯著影響。
白樺脂酸又叫白樺酸和樺木酸,在白樺、鐵刀木、酸棗、大葉胡枝子和杜仲等植物中都有發(fā)現(xiàn)。樺木酸為無(wú)色透明結(jié)晶,能溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑,熔點(diǎn)為316 ℃[30]。白樺酸在白樺樹(shù)皮中的含量約為樹(shù)皮干重的0.025%,雖然天然含量低,但可由白樺脂醇經(jīng)氧化、還原兩步反應(yīng)得到。1994年Fujioka等發(fā)現(xiàn)白樺脂酸可以抑制HIV病毒復(fù)制和有選擇性地抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng),之后越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外廣大科研人員的關(guān)注。大量研究證明其藥理活性多樣,高效低毒,作用機(jī)制不同于常規(guī)藥物,在治療癌癥、降脂、抗病毒、抗艾滋病等方面有望研究出新型藥物,具有廣闊的應(yīng)用前景[31-32]。
目前主要提取方式為索氏提取法[33]、超聲波醇提法、氯仿浸提法、回流法、超臨界萃取[34]和亞臨界提取法等。胡祥正等[35-36]使用索氏提取法,確定乙醇作為提取劑的最佳固液比(g∶mL)為0.083,抽提時(shí)間6 h,再用異丙醇和乙醇作為溶劑,通過(guò)兩步重結(jié)晶純化樺木醇,最終產(chǎn)率為19.8%,純度98%。范桂枝等[37]以白樺為材料對(duì)回流法、索氏提取法、超聲波醇提法和氯仿浸提法提取白樺脂醇進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)索氏提取法和超聲波醇提法提取效率較高。李影等[38]通過(guò)比較不同的提取方法和不同的純化方法,獲得了白樺脂醇提取和純化的最佳方法,使用回流法和重結(jié)晶法,使重結(jié)晶產(chǎn)率達(dá)到38%,純度達(dá)到99.81%。馬博玉等[39]以白樺樹(shù)皮為原料,使用液泛提取設(shè)備,確定了連續(xù)提取白樺脂醇的最佳參數(shù),提取率為90.39%,純度為89.12%。張靜等[40]使用亞臨界提取法對(duì)白樺脂醇提取也得到了較高的提取率。詹亞光等[41]在優(yōu)化白樺愈傷組織提取三萜化合物條件的研究中使用分光光度計(jì)法測(cè)定總?cè)坪堪l(fā)現(xiàn),此方法測(cè)總?cè)品€(wěn)定、方便且重現(xiàn)性好,提取溫度不同會(huì)導(dǎo)致提取結(jié)果發(fā)生變化,提取最佳溫度為40 ℃。綜上所述,三萜化合物的提取和純化方法多種多樣,目前超聲波醇提法效果較好,使用廣泛;重結(jié)晶法的純化效果顯著,但沒(méi)有能應(yīng)用于工業(yè)化大量生產(chǎn)白樺三萜的方式,因此應(yīng)找到一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)且效率高的提取和純化方式。
三萜化合物經(jīng)過(guò)提取后的檢測(cè)工作是評(píng)價(jià)提取純化方式和評(píng)價(jià)樣品中三萜化合物含量的重要工作,因此測(cè)定方法的準(zhǔn)確性和可操作性都極為重要。目前檢測(cè)三萜化合物的主要方式為高效液相色譜法、氣相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法和比色法。張澤等[42]使用高效液相色譜法測(cè)定白樺脂醇的含量,以C18色譜柱,流動(dòng)相為甲醇∶水(88∶12),紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,柱溫30 ℃,流速1 mL·min-1,柱壓6.4 MPa的條件進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示線性范圍為15.0~300.0 μg,平均回收率為93.93%,與氣相色譜法和比色法相比,此方法更準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便。趙國(guó)玲[43]建立了一種能同時(shí)檢測(cè)白樺脂醇和白樺脂酸含量的方法,在C18反應(yīng)柱,流動(dòng)相為乙腈∶水(86∶14),流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣20 mL的條件測(cè)定,此方法結(jié)果準(zhǔn)確度高,R2均在0.99以上,能在20 min內(nèi)完成兩種物質(zhì)的檢測(cè)。于有強(qiáng)等[44]利用高效液相色譜法建立了能同時(shí)檢測(cè)白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的方法,以C18色譜柱,流動(dòng)相甲醇∶水(91∶1),流速0.6 mL·min-1,210 nm紫外檢測(cè)波長(zhǎng),20 μL進(jìn)樣量,結(jié)果顯示R2在0.999 8以上,精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好。譚朝陽(yáng)等[45]使用高效液相色譜法測(cè)定齊墩果酸,結(jié)果有良好的線性關(guān)系,平均回收率為99.69%。孫宏等[46]使用分光光度法對(duì)白樺樹(shù)皮的三萜化合物總量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示精密度RSD為2.16%,回收率為96.16%~98.85%。方玉棟、祁逸梅等[47-48]使用氣相色譜法對(duì)三萜化合物進(jìn)行測(cè)定,此方法對(duì)樣品衍生化后才能測(cè)定,測(cè)量難度大。劉海興等[49]使用毛細(xì)管電泳法有效地測(cè)定了石楠葉中齊墩果酸和熊果酸含量,平均回收率分別達(dá)到102%和104%。從大量研究可以看出,現(xiàn)在普遍用高效液相色譜法檢測(cè)三萜化合物,此方法方便且準(zhǔn)確度高,易重復(fù),能有效測(cè)定三萜化合物含量,缺點(diǎn)是液相色譜法檢測(cè)成本高,樣品數(shù)量多時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力且價(jià)格較高。
白樺產(chǎn)生三萜化合物是植物為了適應(yīng)環(huán)境而長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果,因此積累的量不僅與遺傳因素有關(guān),還與環(huán)境因素有關(guān)。范桂枝等[37]以不同種源的白樺為研究材料,測(cè)定不同種源白樺不同部位的白樺脂醇含量發(fā)現(xiàn),同齡樹(shù)的樹(shù)高、胸徑對(duì)白樺醇的影響不顯著,不同種源間的含量差異顯著,白樺脂醇的含量不僅受到種源和遺傳因素的影響,同時(shí)也受到地理環(huán)境和氣候的影響,在白樺中分布含量為外皮>枝皮>內(nèi)皮>芽>葉>根>花粉。王倩[50]在研究白樺樹(shù)皮中三萜化合物分布時(shí)發(fā)現(xiàn)不同的三萜化合物在不同高度含量差異不顯著,樹(shù)皮最外側(cè)含量最高,內(nèi)側(cè)略有降低,差異不顯著,樹(shù)皮內(nèi)的三萜物質(zhì)含量隨季節(jié)的變化不顯著。李新宇等[51]以白樺幼樹(shù)為材料,研究不同光質(zhì)和光強(qiáng)對(duì)三萜積累的影響,發(fā)現(xiàn)紅、黃、藍(lán)、綠4種光均降低了莖外皮的白樺脂醇和齊墩果酸含量;藍(lán)光處理顯著提高葉片白樺脂醇含量,綠光提高葉片齊墩果酸含量,白樺脂醇和齊墩果酸含量變化顯著受到了季節(jié)的調(diào)控。李春曉等[52]以白樺幼樹(shù)為材料,研究茉莉酸甲酯(MeJA)、水分和氮肥處理對(duì)白樺三萜物質(zhì)積累的影響和白樺三萜的積累規(guī)律,發(fā)現(xiàn)幼樹(shù)總?cè)圃诟ぷ钌?,葉片和莖皮中最多,根皮和莖皮的總?cè)品e累高峰為7月份和8月份,葉片為6月份;干旱脅迫在6月和7月分別有利于葉和莖積累三萜物質(zhì),干旱不利于根中三萜積累;6-7月施氮肥有利于莖中三萜積累,7-10月施氮肥或MeJA都有利于葉和根積累三萜物質(zhì)。
白樺三萜是植物的次生代謝物,含量較低。次生代謝物通常需要特殊的物質(zhì)或環(huán)境刺激才能加快合成,不同植物中不同的次生代謝物往往需要不同的物質(zhì)刺激產(chǎn)生,通過(guò)白樺組織培養(yǎng)和白樺細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可以研究不同物質(zhì)對(duì)白樺三萜積累的影響。
王博等[53]以白樺優(yōu)樹(shù)腋芽為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中NO3-含量略高于NH4+含量及培養(yǎng)基含豐富的有機(jī)物有利于白樺三萜積累,低濃度的6-BA和TDZ有利于三萜積累,過(guò)高或過(guò)低濃度的6-BA和NAA組合都不利于白樺三萜積累,白樺三萜的積累和細(xì)胞分裂生長(zhǎng)不是同步進(jìn)行。尹靜等[54]研究組培苗愈傷組織中三萜化合物分布和含量時(shí)發(fā)現(xiàn),白樺細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可以得到白樺脂醇和齊墩果酸,培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與細(xì)胞的全面接觸和細(xì)胞間物質(zhì)的傳遞,有利于三萜化合物積累。范桂枝等[55]以白樺懸浮系為材料,通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B5培養(yǎng)基和20~30 g·L-1FW的接種量有利于白樺懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)和三萜積累,在培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞生物量和三萜的積累量成正相關(guān),三萜的產(chǎn)量隨生物量的增加表現(xiàn)為增長(zhǎng)趨勢(shì),培養(yǎng)液中的成分降低也會(huì)限制細(xì)胞增殖和三萜的合成。
范桂枝等[56]以白樺組培苗莖段為材料,研究了不同光質(zhì)和光周期對(duì)白樺三萜積累的影響,發(fā)現(xiàn)不同的光質(zhì)和光周期都對(duì)三萜化合物積累有調(diào)節(jié)作用。王博[57]以白樺組培苗為材料,通過(guò)誘導(dǎo)白樺產(chǎn)生愈傷組織,對(duì)愈傷組織進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)和固體組織培養(yǎng),研究白樺三萜在愈傷組織中的代謝調(diào)控發(fā)現(xiàn),以藍(lán)色光質(zhì),強(qiáng)光照,蔗糖濃度為30 mg·L-1,0.8 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-1NAA,IS為基本培養(yǎng)基是最適合白樺三萜產(chǎn)生的固體培養(yǎng)基,藍(lán)光對(duì)白樺愈傷組織積累白樺三萜有利;懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)白樺三萜的效果比固體培養(yǎng)基更好,最佳的懸浮培養(yǎng)條件為B5培養(yǎng)基,添加0.4 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1TDZ,接種量10 g·L-1(FW)。
姜洋等[58]研究一氧化碳(CO)對(duì)白樺懸浮細(xì)胞產(chǎn)生三萜化合物的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),CO對(duì)白樺懸浮細(xì)胞產(chǎn)生三萜物質(zhì)有促進(jìn)作用。黃雅婷等[59]研究硝普鈉(SNP)對(duì)白樺懸浮細(xì)胞積累白樺脂醇的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),SNP分別和K+或Ca2+互作可以更好地促進(jìn)白樺懸浮細(xì)胞積累白樺醇。孫美玲等[60]以白樺懸浮細(xì)胞為材料,研究過(guò)氧化氫(H2O2)介導(dǎo)真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)白樺脂醇積累時(shí)發(fā)現(xiàn),外源H2O2降低細(xì)胞活力和干物質(zhì)積累,提高了白樺酯醇的含量。王艷等[61]在研究鈣離子介導(dǎo)水楊酸(SA)誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞三萜合成的作用時(shí)發(fā)現(xiàn),水楊酸能誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞產(chǎn)生三萜化合物,在鈣離子的作用下,水楊酸的誘導(dǎo)效果被加強(qiáng)。常志凱等[62]研究高溫脅迫對(duì)白樺懸浮細(xì)胞積累三萜化合物的影響,確定了利用高溫脅迫促進(jìn)白樺懸浮細(xì)胞的最佳溫度為50 ℃,脅迫2 h后24 h取樣。翟俏麗等[63]使用真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)了白樺懸浮細(xì)胞中三萜的積累。
目前,白樺三萜經(jīng)過(guò)多年的研究取得了一定的進(jìn)展。①白樺三萜的提取、純化和檢測(cè)方面,眾多學(xué)者研究了多種方法,以超聲波醇提法為主要的三萜提取方法,此方法相對(duì)簡(jiǎn)便且效率高;白樺三萜的純化主要用重結(jié)晶法,此方法得到的純化產(chǎn)物純度較高;白樺三萜的含量檢測(cè)主要為高效液相色譜法,此方法能有效分離檢測(cè)不同三萜化合物的含量,檢測(cè)精確度高,可重復(fù)性強(qiáng)。②白樺三萜在白樺中分布積累的特點(diǎn),樹(shù)中大部分都有分布,樹(shù)干外皮三萜含量最高,花粉中最少;白樺三萜的含量不受樹(shù)高和莖粗的影響;種源、樹(shù)齡和季節(jié)會(huì)影響三萜含量,但具體原因還不清楚,可能與季節(jié)變化的溫度、光照、降雨量等發(fā)生變化有關(guān);通過(guò)水分、氮肥、茉莉酸甲酯等物質(zhì)可調(diào)控白樺三萜的積累。③通過(guò)組織培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)白樺愈傷組織可以產(chǎn)生三萜化合物,且改變培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)條件都可調(diào)控三萜化合物的積累。④通過(guò)固體培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),光質(zhì)、光強(qiáng)、溫度等環(huán)境因子和水楊酸、H2O2、CO、真菌誘導(dǎo)子、SNP、K+、Ca2+等多種物質(zhì)都對(duì)白樺三萜的積累有影響,通過(guò)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件可有效提升白樺三萜的產(chǎn)量。
通過(guò)大量的研究,白樺可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞教嵘飘a(chǎn)量,但是提升的量不足以改變產(chǎn)量低的現(xiàn)狀。白樺生長(zhǎng)周期長(zhǎng),通過(guò)樹(shù)皮獲取三萜物質(zhì)會(huì)破壞大量白樺資源。利用細(xì)胞懸浮技術(shù)培養(yǎng)白樺細(xì)胞,研究三萜物質(zhì)的產(chǎn)生和積累效率更高、周期短,能節(jié)省大量人力物力。目前可以繼續(xù)以細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方式研究白樺三萜在細(xì)胞中合成和積累的機(jī)理,找到能引導(dǎo)細(xì)胞大量合成白樺三萜的方式,結(jié)合基因工程技術(shù),最終獲得專產(chǎn)三萜物質(zhì)的細(xì)胞,使三萜物質(zhì)能工業(yè)化大量生產(chǎn),為三萜化合物的應(yīng)用研究提供保障,最終為人類的疾病治療提供服務(wù)。