林珊，戴麗冰，翁春輝，趙向陽(yáng)，郭愛芳

（1.廣東燕嶺醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510507；2.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院，廣州市創(chuàng)傷外科研究所，廣東 廣州 510220；3.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510220）

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，保護(hù)巨噬細(xì)胞的完整性是保障其功能穩(wěn)步發(fā)揮的前提。巨噬細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能完整性受外源自由基的侵襲時(shí)，會(huì)出現(xiàn)被氧化分解或裂解，嚴(yán)重降低其對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)屏障功能[1-2]。因此，提高機(jī)體免疫力，首先應(yīng)提升巨噬細(xì)胞抗氧化能力。目前，已有關(guān)于提高免疫細(xì)胞抗氧化能力的研究，相應(yīng)的抗氧化物質(zhì)主要為維生素類，如維生素C、維生素E以及礦物質(zhì)類，如酵母硒[3]。隨著我國(guó)對(duì)中草藥現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的深入研究，有關(guān)中草藥提取物抗氧化物質(zhì)功效的試驗(yàn)研究也備受關(guān)注。本研究以菊科植物純化提取的半萜烯內(nèi)脂類化合物小白菊內(nèi)酯為研究對(duì)象，對(duì)其影響巨噬細(xì)胞抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 巨噬細(xì)胞 外購(gòu)15只SPF級(jí)8周Balb/c小鼠（維通利華），以10 μg/g 體質(zhì)量腹腔注射大腸桿菌脂多糖500 μL/只構(gòu)建炎癥模型動(dòng)物。與模型構(gòu)建后24～72 h 內(nèi)監(jiān)測(cè)小鼠血液CRP 指標(biāo)變化，對(duì)成功獲取的15 只炎癥模型動(dòng)物處死后置于無(wú)菌操作臺(tái)，利用冷PBS（pH 7.4～7.6）進(jìn)行腹腔沖擊收集巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外離心和分離培養(yǎng)（37 ℃5%CO2），經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶檢測(cè)及吞噬試驗(yàn)鑒定后，篩選出巨噬細(xì)胞分為兩份，一份凍存，另一份以1×104個(gè)/mL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.1.2 儀器及試劑 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Sheldon 公司），低溫離心機(jī)（美國(guó)Herculeus公司），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），小白菊內(nèi)酯（PTN，美國(guó)Sigma 公司），脂多糖（LPS，Sigma L2630），鼠IL-1βELISA 試劑盒（聯(lián)科生物，70-EK201B/3-24），鼠 TNF-α ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物，70-EK282/3-24），鼠IL-6ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物，70-EK206/2-24），維生素 C（上海阿拉丁），丙二醛（MDA，Sigma MAK085），超氧化物歧化酶（SOD，Sigma 19160），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，Sigma CGP1）。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)及分組 巨噬細(xì)胞體外分離及培養(yǎng)：炎癥模型動(dòng)物建模完成后，在注射脂多糖后24、48、72 h進(jìn)行血樣采集監(jiān)測(cè)動(dòng)物體溫及血清CRP指標(biāo)變化篩選出炎癥構(gòu)建成功的模型動(dòng)物。確認(rèn)動(dòng)物炎癥模型成功后，當(dāng)日對(duì)其處死，并采用冷PBS 腹腔沖擊收集巨噬細(xì)胞1 000 rpm 離心8 min，獲得的疑似巨噬細(xì)胞以1×104個(gè)/mL濃度培養(yǎng)到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，200 μL/孔。細(xì)胞培養(yǎng)6～8 h 后進(jìn)行相差倒置顯微鏡檢查細(xì)胞形態(tài)，標(biāo)注出有偽足的單核細(xì)胞，培養(yǎng)第72 小時(shí)對(duì)標(biāo)注孔細(xì)胞行墨汁吞噬功能檢測(cè)（10%墨汁50 μL/孔），于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其吞噬率。同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)第72小時(shí)標(biāo)注孔實(shí)施堿性磷酸酶染色，同樣于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算胞漿棕黃色或棕黑色細(xì)胞陽(yáng)性率。

分組：經(jīng)體外分離驗(yàn)證陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞孔補(bǔ)加含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，于體外培養(yǎng)5～7 d，當(dāng)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔底鋪滿80%左右細(xì)胞時(shí)，使用0.25%胰酶消化離心，去上清后沉淀細(xì)胞平均分為兩部分，一部分凍存（凍存液：9 份血清+1 份DMSO），另一部分巨噬細(xì)胞繼續(xù)以1×104個(gè)/mL稀釋鋪板培養(yǎng)，共計(jì)15塊96孔板，200 μL/孔。將含有巨噬細(xì)胞的15塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板隨機(jī)分為5組，每組3塊，分別為對(duì)照組、A組、B組、C組及D組。各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)板在培養(yǎng)第48小時(shí)分別對(duì)應(yīng)0 μmol/L PTN+1 mg/L LPS（空白對(duì)照）、7.5 μmol/L PTN+1 mg/L LPS、15 μmol/L PTN+1 mg/L LPS、30 μmol/L PTN+1 mg/L LPS及200 μmol/L維生素C+1 mg/L LPS，上述各組細(xì)胞在相同培養(yǎng)條件下實(shí)施體外持續(xù)共培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞炎性因子水平及抗氧化能力檢測(cè) 以加入PTN為0 h，0 h各組間的IL-1β、TNF-α和IL-6水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。依據(jù)分組加入PTN 后，于培養(yǎng)第24、48 及72 小時(shí)收集各組細(xì)胞上清液，對(duì)細(xì)胞上清液中炎性因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）水平進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)，同時(shí)，對(duì)細(xì)胞抗氧化能力指標(biāo)（SOD、MDA及GSH-Px）水平進(jìn)行檢測(cè)。以上各種指標(biāo)均嚴(yán)格依照廠家提供的產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照分梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)含量。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組炎性因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）水平及細(xì)胞抗氧化能力指標(biāo)（SOD、MDA及GSH-Px）水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“”表示，行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察、堿性磷酸酶染色陽(yáng)性率及吞噬率 培養(yǎng)6～8 h觀察細(xì)胞呈現(xiàn)圓形或橢圓形，部分伸出偽足呈現(xiàn)三角形或不規(guī)則多邊形，培養(yǎng)24 h觀察細(xì)胞均出現(xiàn)偽足且形態(tài)不變。15只小鼠培養(yǎng)72 h經(jīng)墨汁吞噬率及堿性磷酸酶染色陽(yáng)性率比較發(fā)現(xiàn)，平均每200 個(gè)細(xì)胞中有191 個(gè)出現(xiàn)墨汁吞噬染色，吞噬率為95.5%；堿性磷酸酶染色統(tǒng)計(jì)，平均每200個(gè)細(xì)胞中有183個(gè)被染色沉淀，陽(yáng)性率為91.5%。

2.2 各組不同時(shí)間段細(xì)胞炎性因子水平變化比較 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，A 組、B 組、C 組及 D 組 IL-1β、TNF-α 及 IL-6 水平均呈下降趨勢(shì)，而對(duì)照組IL-1β、TNF-α及IL-6水平炎性因子水平均呈上升趨勢(shì)。與PNT共培養(yǎng)24、48 h，C組IL-1β顯著低于其他各組（P＜0.05），72 h 時(shí)，對(duì)照組IL-1β 水平顯著高于其他各組（P＜0.05）；與PNT共培養(yǎng)24 h，C組TNF-α顯著高于其他各組（P＜0.05），72 h 時(shí)，C 組TNF-α 顯著低于其他各組（P＜0.05），且對(duì)照組顯著高于其他各組（P＜0.05）；與PNT共培養(yǎng)24、48及72 h，各組IL-6水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 不同時(shí)間段各組細(xì)胞炎性因子水平變化比較（）Table 1 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in different time among different groups()

表1 不同時(shí)間段各組細(xì)胞炎性因子水平變化比較（）Table 1 Comparison of the levels of inflammatory cytokines in different time among different groups()

注：IL-1β，白介素1β；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-6，白介素-6。與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組A組（n=3）B組（n=3）C組（n=3）D組（n=3）72 h 105.65±9.91 79.33±7.23 83.44±11.23 84.30±16.43 80.88±20.26 IL-1β（mg/L）24 h 59.78±6.27b 58.85±6.46b 57.88±6.82b 43.64±8.18 58.66±9.23b 48 h 60.82±8.83b 53.34±9.96b 52.78±7.34b 41.45±4.67 52.43±8.74b 72 h 62.13±5.44 47.49±6.16a 44.29±5.24a 40.33±2.14a 46.63±3.17a TNF-α（ng/L）24 h 202.15±10.44b 228.34±19.66b 224.23±34.36b 314.87±38.26 236.17±37.88b 48 h 235.23±21.56 216.23±28.18 208.18±63.12 221.23±45.96 218.94±45.23 72 h 258.88±29.19b 203.10±29.57ab 197.58±20.16ab 155.80±26.21a 196.93±20.41ab IL-6（pg/mL）24 h 72.15±10.44 112.23±9.87 119.16±13.54 129.23±21.34 107.99±20.24 48 h 84.34±11.33 86.88±10.44 80.95±17.24 91.26±14.67 89.13±13.36

2.3 各組不同時(shí)間段細(xì)胞抗氧化能力指標(biāo)SOD、MDA 及GSH-Px水平變化 與PNT共培養(yǎng)24 h，各組SOD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共培養(yǎng) 48 及 72 h，A 組、B 組、C 組及 D 組 SOD 均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，A 組、B組、C組及D組SOD水平呈下降趨勢(shì)；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各組MDA 均呈下降趨勢(shì)，共培養(yǎng)24 h，各組MDA 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共培養(yǎng)48及72 h，C組MDA均顯著低于其他各組（P＜0.05）；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，A 組GSH-Px 水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，共培養(yǎng)24 h，各組GSH-Px水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共培養(yǎng)48及72 h，C組GSH-Px水平均顯著高于其他各組（P＜0.05），見表2。

表2 不同時(shí)間段各組細(xì)胞抗氧化指標(biāo)SOD、MDA及GSH-Px水平比較（）Table 2 Comparison of SOD,MDA and GSH PX levels in different time among different groups()

表2 不同時(shí)間段各組細(xì)胞抗氧化指標(biāo)SOD、MDA及GSH-Px水平比較（）Table 2 Comparison of SOD,MDA and GSH PX levels in different time among different groups()

注：SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛；GSH-Px，谷胱甘肽過氧化物酶。與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組A組（n=3）B組（n=3）C組（n=3）D組（n=3）72 h 67.46±8.81b 73.34±6.78b 73.46±7.01b 90.46±10.64 73.14±9.16b 24 h 49.10±8.37 52.15±9.57 53.19±10.79 55.26±14.19 53.56±9.74 48 h 44.14±8.16 58.33±10.23a 58.74±8.96a 68.86±11.46a 60.66±8.98a 72 h 38.26±10.13 60.19±11.44a 61.35±9.87a 75.79±9.99a 65.75±11.09a 24 h 1.01±0.22 1.07±0.27 1.10±0.31 1.08±0.29 1.07±0.40 48 h 0.84±0.23b 0.69±0.16b 0.69±0.24b 0.34±0.14 0.77±0.09b 72 h 0.77±0.18b 0.55±0.14b 0.54±0.16b 0.28±0.13 0.54±0.14b 24 h 72.89±11.47 69.34±8.48 71.61±7.24 75.02±8.59 68.60±10.32 48 h 70.98±8.89b 70.12±9.24b 72.89±6.45b 89.89±10.91 70.33±8.08b

3 討論

小白菊內(nèi)酯是一種具有抑菌抗腫瘤作用的生物活性物質(zhì)，是野生甘菊的提取物，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，其中在痛風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及抗腫瘤方面具有顯著效果[4-5]。有關(guān)小白菊內(nèi)酯上述功效的作用機(jī)理，有研究發(fā)現(xiàn)小白菊可通過NF-kappa B通道抑制從而起到促進(jìn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖抑菌功效。但小白菊內(nèi)酯對(duì)免疫細(xì)胞的影響功效機(jī)制以及對(duì)炎性因子的作用研究較少，小白菊內(nèi)酯對(duì)免疫細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞功效及抗氧化功能的報(bào)道缺乏大量數(shù)據(jù)參考[6-7]。巨噬細(xì)胞是參與機(jī)體免疫的重要抗原遞呈細(xì)胞，通過MHC分子與抗原結(jié)合從而誘發(fā)機(jī)體T 細(xì)胞及B 細(xì)胞參與特異性免疫反應(yīng)，然而巨噬細(xì)胞在參與免疫過程中通過釋放促炎因子而起到機(jī)體保護(hù)作用，并通過釋放抗炎細(xì)胞因子從而有效調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)抵御外源致病因素侵襲[8-9]。有研究報(bào)道，小白菊內(nèi)酯在牙周炎的治療中，主要通過激活巨噬細(xì)胞活性，促進(jìn)炎性因子介入從而有效抑制外界病原的侵襲；同時(shí)，小白菊內(nèi)酯可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)改善巨噬細(xì)胞的抗氧化能力[10-12]。

目前機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)主要由小分子物質(zhì)和抗氧化酶兩部分組成，小分子物質(zhì)中主要以維生素C和維生素E的應(yīng)用較多，而抗氧化酶中以超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶為主[13-14]。通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)抗氧化物酶的活性可有效抑制體內(nèi)自由基產(chǎn)生，從而抑制細(xì)胞氧化維持細(xì)胞正常功能，目前對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的評(píng)價(jià)中除了以SOD、MDA及GSHPx水平變化進(jìn)行分析外，SOD及GSH-Px參與抗氧化重要的酶，通過其含量可抑制自由基的作用，而MDA是機(jī)體體脂氧化代謝的重要物質(zhì)，MDA 在機(jī)體的水平與機(jī)體抗氧化能力呈負(fù)相關(guān)[15-16]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，目前的疾病療效判定中，主要以TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎性因子水平來(lái)評(píng)定疾病改善情況，這些炎性因子均是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，主要參與機(jī)體的多種免疫及生理反應(yīng)，在機(jī)體維持免疫平衡中發(fā)揮重要作用[17]。

本研究結(jié)果表明，陽(yáng)性巨噬細(xì)胞占比90%以上，細(xì)胞形態(tài)符合巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，A組、B組、C組及D組IL-1β、TNF-α及IL-6水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而對(duì)照組的IL-1β、TNF-α及IL-6水平均呈上升趨勢(shì)，表明PTN可抑制炎性因子 IL-1β、TNF-α 及 IL-6 的分泌；在與 PNT 共培養(yǎng)24 h，C 組IL-1β、TNF-α 均顯著高于其他各組（P＜0.05），且共培養(yǎng)48 h，C組的IL-1β顯著低于其他各組（P＜0.05），說(shuō)明30 μmol/L PTN 在于LPS 共培養(yǎng)初期可提高巨噬細(xì)胞功能，并促進(jìn)炎性因子分泌，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，LPS 致炎量被中和后，巨噬細(xì)胞的炎性分泌量相應(yīng)降低且受多余的PTN 影響進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞致炎因子的分泌。共培養(yǎng)48 及72 h，C組GSH-Px 水平均顯著高于其他各組（P＜0.05），C 組MDA水平顯著低于其他各組（P＜0.05），72 h時(shí)，對(duì)照組SOD水平均顯著低于其他各組（P＜0.05），說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)C組PNT 可提高巨噬細(xì)胞的抗氧化能力，降低細(xì)胞裂解減少丙二醛的分泌。同時(shí)，各組在不同時(shí)間段的IL-6水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初步認(rèn)定PTN 對(duì)炎性因子IL-6 無(wú)顯著效果，但仍需進(jìn)一步給予證實(shí)。

綜上所述，小白菊內(nèi)酯可抑制脂多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的致炎作用，同時(shí)以30 μmol/L PTN量加入到巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中，早期可抑制炎性因子分泌；同時(shí)，小白菊內(nèi)酯可提高巨噬細(xì)胞的抗氧化能力，且30 μmol/L PTN+1 mg/L LPS 進(jìn)行體外抗氧化效果最佳。