溫澤宇，于大永，王 柳，史麗穎

（大連大學生命科學與技術學院，遼寧 大連116622）

Wnt信號通路是由配體蛋白質Wnt與膜蛋白受體結合激發(fā)的一組多下游通道的信號轉導途徑，在胚胎發(fā)育和多種癌癥的形成過程中起著至關重要的作用[1].在Wnt通路中，β-catenin裂解復合物是一種重要的調節(jié)因子，由Adenomatous polyposis coli（APC）、軸抑制蛋白（axin）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）和酪蛋白激酶1α（CK1α）組成，它嚴格控制著β-catenin的水平[2].在Wnt信號沒有被激活的情況下，細胞質中的β-catenin保持在較低水平.在大多數癌細胞中可觀察到Wnt信號通路被異常激活，β-catenin裂解復合物發(fā)生降解，使得β-catenin積累并且移位到細胞核中[3-4].Axin蛋白是Wnt信號通路的負反饋調節(jié)因子，可降低β-catenin的水平，抑制Wnt通路基因轉錄.有研究報道[5-8]，端錨聚合酶（tankyrase，TANKS）可以降低Axin蛋白的表達量，它是多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）家族的一員.端錨聚合酶抑制劑可使Axin蛋白積累，進而降解β-catenin，阻止其向細胞核轉運并降低Wnt通路基因的表達[9].端錨聚合酶能夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）為底物，生成附著在靶蛋白上的ADP-核糖聚合物.TANK1和TANK2是端錨聚合酶的2個異構體，蛋白序列高度保守，同源性高達80%[10-11].同PARP家族其他成員類似，端錨聚合酶的催化結構域由1個結合并水解NAD+的供體位點和1個容納目標蛋白的受體位點組成，供體部位含有煙酰胺位點和腺苷位點[12-13].供體位點構象的特征是封閉且靈活，當供體位點與NAD+或抑制劑結合時，端錨聚合酶D環(huán)上具有靈活構象的氨基酸被動發(fā)生移位，允許NAD+或抑制劑進入溝槽[14-15].自20世紀70年代以來，許多研究[16-18]發(fā)現，在PARP家族成員中高度保守的煙酰胺位點是端錨聚合酶抑制劑（如xav939）作用的唯一靶點.最近研究發(fā)現[19]，一種新型的抑制劑（IWR1）可結合在TANK1的腺苷口袋中，與結合口袋周圍氨基酸的作用方式相比于其他PARP家族成員較為保守，表明此類抑制劑對端錨聚合酶具有很高的選擇性.腺苷口袋是由α3螺旋和D環(huán)上的氨基酸Phe1188運動產生的，定義腺苷口袋的結構特征和結合模式對于開發(fā)高選擇性且強效的端錨聚合酶抑制劑具有重要指導意義.

為了深入了解端錨聚合酶腺苷位點處抑制劑的作用方式，本研究從文獻[12-15，20-21]中選取活性和非活性抑制劑組成訓練集和測試集，訓練集用來構建基于配體共同特征的藥效團模型，測試集用來驗證模型的準確性.將活性抑制劑對接于腺苷結合位點，研究活性抑制劑的作用模式，對比分析關鍵氨基酸與活性抑制劑的普遍作用模式.將分子對接結果與藥效團模型結合，進一步構建更精確的藥效團模型，反映抑制劑對腺苷位點的關鍵作用方式以及作用模式.該藥效團模型可用于端錨聚合酶抑制劑的開發(fā)和篩選.

1 材料與方法

1.1 小分子的制備

根據文獻[12-14，20]，選擇15種端錨聚合酶抑制劑作為訓練集，構建基于配體共同特征的藥效團，15種抑制劑的結構如圖1所示，其活性如表1所示.

表1 訓練集中抑制劑的活性Tab.1 Activity of the inhibitors in the training set

圖1 訓練集中抑制劑的結構Fig.1 Molecular schematics of the inhibitors in the training set

這些小分子結構用SYBYL6.9.1中的Steepest Descent算法進行疊加和優(yōu)化，然后采用共軛梯度和牛頓-拉夫森算法優(yōu)化，收斂梯度分別為0.4、0.04和0.004 kJ/mol[22].隨機選用抑制劑1、5、7、9、11和13進行分子對接實驗.

1.2 共同特征藥效團的建模和驗證

以15種抑制劑作為訓練集，在InsightⅡ軟件中，利用HipHop模塊生成基于配體共同特征的藥效團.在參數設置上，選擇氫鍵供體（D）、氫鍵受體（A）、疏水基團（H）、共軛環(huán)（R）和正電離中心（P）5個特征.設置藥效團的構象最多生成數為10.此外，參考訓練集的活性數據，設置“Principal”值為2，“MaxOmitfeat”值為1，其他參數設置為默認值.

在Ligand Profiler模塊中，通過由11個活性端錨聚合酶抑制劑和6個非活性抑制劑組成的測試集驗證藥效團，測試集化合物的活性如表2所示.為了將測試集的所有配體與藥效團匹配，設置maximum omitted features為0，其他參數設置為默認參數.

表2 測試集中抑制劑的活性Tab.2 Activity of the inhibitors in the test set

1.3 蛋白準備

從蛋白質數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/）下載TANK1（PDB：4K4F）[23]的晶體結構.利用Schrodinger軟件刪除蛋白中的水分子，加入晶體結構缺失的氫原子和氨基酸殘基，在pH值為7.4的環(huán)境下，對氨基酸的質子化帶電狀態(tài)進行調節(jié).通過原子力場OPLS2005，將晶體結構的氫原子能量最小化.

1.4 分子對接

分別利用Glide、AutoDock 4.2和AutoDock Vina 1.1軟件，將訓練集中的15個小分子抑制劑與TANK1蛋白對接.以晶體結構中天然配體的位置為活性中心，坐標位置：x=-8.89，y=41.75，z=27.93.在AutoDock中，設置活性位點口袋大小為4 nm×4 nm×40 nm.利用Glide中的SP和XP這2種對接精度進行對接.

2 結果與分析

2.1 共同特征藥效團

以15種端錨聚合酶抑制劑為訓練集，利用HipHop模塊生成基于配體共同特征的藥效團，結果如表3所示.藥效團假設大致可分為4類：RHAAA（01、02、03）、HHAAA（04、05、06）、RHHAA（07、08、10）、RRHHA（09）.產生的10個藥效團得分范圍為177.785~193.601.

表3 由HipHop模塊生成的共同特征藥效團Tab.3 Pharmacophore based on the common features generated by the HipHop

2.2 驗證藥效團模型

為了獲得更準確的藥效團，利用測試集對藥效團進行測試.將測試集映射到藥效團上，得到了1個熱度圖，如圖2（a）所示.測試集和藥效團的擬合值可以用熱度圖中的顏色條表示：藍色代表低擬合值，綠色代表中等擬合值，黃色、橙色和紅色代表高擬合值，黑色和白色分別代表最低擬合值和最高擬合值.根據對熱度圖結果的分析，在假設8（Hyp08）中，活性抑制劑A1—A11的擬合值高于非活性抑制劑B1—B6的擬合值.假設8的結構如圖2（b）所示.

圖2 測試集對藥效團的測試結果Fig.2 Test result of the test set against pharmacophore models

為了進一步研究構效關系，從訓練集中選擇了6種抑制劑（抑制劑1、3、5、9、10和14）映射到假設8，結果如圖3所示.由圖3可以看出，大多數抑制劑可以與藥效團模型相匹配，其中，吡咯和苯環(huán)映射到共軛環(huán)（R）特征，疏水基團（H1和H2）與苯環(huán)和環(huán)己烷相匹配，氫鍵受體（A1和A2）與羰基、吡啶、三唑烷和乙腈匹配.抑制劑5和抑制劑9與氫鍵受體（A1）不匹配.該藥效團模型能夠反映出抑制劑的結構特征，但未考慮抑制劑在蛋白質活性部位的構象因素，因此還需要用分子對接結果優(yōu)化該藥效團模型.

圖3 藥效團特征在6個具有代表性的抑制劑上的2D映射Fig.3 2D mapping of the pharmacophore features onto the six representative inhibitors

2.3 分子對接

用4種不同的對接方法將15種抑制劑與TANK1（PDB：4K4F）腺苷位點對接.首先對方法進行評價，分別利用4種對接方法將TANK1與天然配體進行對接.將對接后的天然配體與原天然配體構象進行比較，分析兩者之間的均方根偏差（RMSD）.4種對接結果的RMSD值：AutoDock為0.633 nm，AutoDockVina為0.537 nm，Glide SP為0.486 nm，Glide XP為0.436 nm.RMSD值均低于2 nm，因此認為4種對接方法均合理.分別利用4種對接方法將15種抑制劑與TANK1腺苷位點對接，結果如表4所示.將4種對接軟件的對接分數值同活性數據進行對比，與AutoDock和AutoDockVina相比，Glide對接程序的對接數據與活性數據的相關性更高.在對接模擬過程中，Glide XP的對接精度設置優(yōu)于SP，因此，在后續(xù)的作用方式研究中，選取Glide XP對接構象進行研究.

表4 不同軟件的對接結果Tab.4 Summary of the docking results in different software（kJ/mol）

為了進一步分析抑制劑與端錨聚合酶的結合方式，將部分抑制劑（1、3、5、9、13）疊合在腺苷位點上，結果如圖4所示.抑制劑的骨架符合腺苷位點的形狀，深入占據了腺苷口袋的A、B、C 3個位點.TANK1的活性位點如圖5所示.從訓練集中選擇抑制劑1、5、7、9、11和13與TANK1進行互作模式分析，抑制劑與TANK1活性部位對接的結果如圖6所示.

圖4 TANK1抑制劑于腺苷活性口袋處排列的三維視圖Fig.4 Three-dimensional view of the TANK1 inhibitors arranged in the adenosine active pocket

圖5 TANK1活性位點示意圖Fig.5 Schematic representation of the TANK1 active site

抑制劑1與腺苷位點的相互作用如圖6（a）所示.在A位點處，惡唑啉酮上的羰基與Tyr 1213形成氫鍵，Phe 1208、Tyr 1203和Ile 1228與惡唑啉酮上的甲基和苯環(huán)形成疏水作用，Phe 1188與苯環(huán)形成π-π共軛作用.在C位點處，Asp1 198和Gly 1196分別與酰胺上的羰基和喹啉6位的—CH形成氫鍵.喹啉與其對立位置D環(huán)上的His 1201形成π-π共軛作用.

在C位點處，抑制劑9、11和13（圖6（b）、圖6（c）、圖6（d））與抑制劑1不同，它們以更穩(wěn)定的基團取代氨基喹唑啉酰胺，這些基團與Asp 1198和Gly 1196形成氫鍵.抑制劑9和抑制劑11的嘧啶以及抑制劑13的苯環(huán)都與D環(huán)上的His 1201形成共軛作用.抑制劑11和抑制劑13含有環(huán)己烷，而抑制劑9含有苯環(huán)，在B位點處的對接構象顯示，抑制劑9中心的苯環(huán)垂直于吡啶環(huán)，這種特殊構象能夠使抑制劑的吡啶深入填充到由TANK1的Ser 1186、Phe 1188和Ala 1202形成的疏水溝槽中，形成更強的疏水作用.

圖6 抑制劑與TANK1活性部位的對接Fig.6 Docking of inhibitors into the active site of TANK1

抑制劑5和抑制劑7（圖6（e）和圖6（f））與其他抑制劑的構象差異顯著，但在A和C位點處，仍可以觀察到三唑胺和惡唑上的氮原子與Tyr 1213和Asp 1198形成氫鍵，苯環(huán)與D環(huán)上的Phe 1188和His 1201形成共軛作用.在A位點處，TANK1 apo結構上Tyr1213的苯環(huán)與抑制劑甲氧基苯中的苯環(huán)重疊，這種構象可能會增加抑制劑的效力.

2.4 建立腺苷位點內的相互作用模型

基于配體共同特征生成的藥效團模型假設08被映射到6種抑制劑上，除抑制劑5和抑制劑9外，其余4種抑制劑與藥效團特征相匹配.觀察藥效團模型與抑制劑的匹配情況，發(fā)現藥效團模型與分子對接結果不能完全匹配.用分子對接結果對藥效團模型進行評價，可以獲得更準確的藥效團模型.總結分子對接實驗發(fā)現，抑制劑在腺苷位點處的結合模式較保守：抑制劑與A位點上的Tyr1213、C位點上的Asp1198和Gly 1196形成3個關鍵的氫鍵，在C位點處，抑制劑與對立位置的His 1201形成共軛作用.在藥效團模型假設08（RHHAA）的5個特征中，氫鍵受體特征都在C位處，同時缺失能與D環(huán)上His 1201形成共軛作用的特征.

為了獲得更準確的藥效團，將與TANK1對接后的抑制劑疊合起來，保持其在活性部位的構象，將這些抑制劑分為2組：抑制劑1~8為第1組，抑制劑9~15為第2組.使用相同的參數設置構建藥效團.第1組藥效團包含6個特征，得分范圍為100.868~121.789，新模型中假設f（RHHAA）具有最佳的相關性；第2組藥效團包含5個特征，得分范圍為55.643~73.967，假設a（RHHDA）具有最佳的相關性.將2個藥效團疊加，得到了精確的藥效團模型（RRHHAAD），如圖7所示.

圖7 精確藥效團假說在TANK1活性位點上的疊加Fig.7 Superimposition of the refined pharmacophore hypothesis onto the TANK1 active sites

在該藥效團中，3個保守氫鍵特征分布在腺苷口袋的A和C位點處，這與分子對接實驗得到的保守結合模式一致；2個共軛環(huán)（R1和R2）特征分別定義在A和C位點處，與Phe 1188和His 1201形成共軛作用；腺苷位點的中心（B位點）處有1個關鍵的疏水特征（H2）；另外，模型還有2個氫鍵受體特征（A1和A2）和1個氫鍵供體特征（D）.這些關鍵特征在提高抑制劑的活性和穩(wěn)定性方面起著至關重要的作用，疊加后得到的藥效團可以準確反映腺苷位點的特征，也可以解釋抑制劑與端錨聚合酶的互作方式.

3 結論

本研究選取了15種端錨聚合酶抑制劑，先根據抑制劑的共同特點生成了具有5個特征的藥效團假設08（RHHAA）：2個疏水特征、1個芳香環(huán)、2個氫鍵受體.隨后從訓練集中選擇了6種抑制劑映射到藥效團上，發(fā)現有2種抑制劑與藥效團模型不匹配.將15種活性抑制劑與TANK1對接，分析分子對接結果，推測抑制劑若能夠占據B位點與周圍氨基酸殘基形成廣泛的疏水相互作用，同時與Tyr 1213、Asp 1198和Gly 1196形成氫鍵，則具有良好的活性.將分子對接結果與藥效團假設08進行比較，結果顯示分子對接結果與藥效團假設08特征不能完全匹配.為了獲取更加精準的藥效團模型，以分子對接產生的抑制劑構象為基礎，將15種抑制劑分為2組，根據基于配體共同特征生成的藥效團，對比藥效團假設08的化學特征以及各特征位置，保留藥效團08原有特征并融合新構建的藥效團模型特征，最終得到了一個更加優(yōu)化的藥效團（RRHHAAD）.在該藥效團中，3個保守氫鍵特征分布在腺苷口袋的A和C位點處，2個共軛環(huán)（R1和R2）特征分別定義在A和C位點處，與端錨聚合酶的Phe1188和His1201形成共軛作用；腺苷位點的中心（B位點）處有1個關鍵的疏水特征（H2）；另外，模型中還有2個氫鍵受體特征（A1和A2）和1個氫鍵供體特征（D）.該藥效團與分子對接結果一致，能更好地反映端錨聚合酶腺苷活性位點的特征.