范明江，閆魯霞，徐 蕾，張 園，熊廷川，朱長(zhǎng)軍

（1.新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū) 喀什844000；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；3.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；4.新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)院（附屬腫瘤醫(yī)院）腫瘤防治研究所，烏魯木齊830011）

基因組不穩(wěn)定是腫瘤細(xì)胞的重要標(biāo)志，引起基因組不穩(wěn)定的原因是細(xì)胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制以及DNA損傷修復(fù)分子通路中的相關(guān)蛋白發(fā)生突變或者錯(cuò)誤表達(dá)導(dǎo)致的基因功能異常[1].P53基因是一種廣譜的腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物P53具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)的作用.P53結(jié)合蛋白1（p53 binging protein，53BP1）能夠與P53相互結(jié)合，其基因定位在人15號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)5帶~2區(qū)1帶，全長(zhǎng)6.6 kb，編碼1 972個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為217×103[2].53BP1可在修復(fù)DNA雙鏈斷裂損傷（DSB）途徑中發(fā)揮重要作用.Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在DSB發(fā)生后第一時(shí)間53BP1可被蛋白激酶ATM磷酸化且聚集在DNA損傷處，ATM磷酸化的53BP1持續(xù)聚集在DNA損傷位點(diǎn)，能夠阻止DNA雙鏈損傷的正常同源重組修復(fù)，最終引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生.

乳腺癌是一種常發(fā)生于乳腺上皮組織的的婦科惡性腫瘤[4].按照乳腺癌細(xì)胞表面雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、表皮生長(zhǎng)因子2受體（HER-2）等表達(dá)的不同，可將乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A、Luminal B、HER2陽(yáng)性和三陰性等類(lèi)型.Luminal A型乳腺癌的特點(diǎn)為：ER+、和/或PR+、HER2-，與其他類(lèi)型乳腺癌相比較，Luminal A型乳腺癌預(yù)后相對(duì)較好.Luminal B型乳腺癌的特點(diǎn)為：ER+、和/或PR+、HER2+，Luminal B型乳腺癌腫塊大，組織學(xué)分級(jí)高，易發(fā)生脈管轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.HER2過(guò)表達(dá)型乳腺癌的特點(diǎn)為：ER-、PR-、HER2+，該亞型乳腺癌所占比例約為20%.三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的特點(diǎn)為：ER-、PR-、HER2-，該亞型乳腺癌所占比例為15%~20%[5].乳腺癌種類(lèi)繁多，危害極大，但目前臨床上仍缺少特異性早期分子診斷的方法.

本研究通過(guò)制備特異性抗磷酸化53BP1血清，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白免疫印跡雜交實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光染色等方法，對(duì)抗磷酸化53BP1抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，以期揭示磷酸化53BP1抗體與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

根據(jù)磷酸化53BP1蛋白分子一級(jí)結(jié)構(gòu)中的第25位和第29位氨基酸設(shè)計(jì)制備磷酸化53BP1抗體的抗原多肽CIEDpSQPEpSQVLEDD，由杭州丹港生物科技有限公司合成；通用型免疫組化試劑盒，武漢博士德生物公司；乳腺癌組織芯片，上海卓灝醫(yī)藥科技有限公司（芯片編號(hào)：BRC2281）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷酸化53BP1抗體制備

磷酸化53BP1抗體由實(shí)驗(yàn)室自主制備，經(jīng)蛋白免疫共沉淀（IP）、免疫印跡雜交（WB）、免疫熒光染色（IF）驗(yàn)證了抗體的特異性[6].

1.2.2 免疫組化染色檢測(cè)

應(yīng)用通用型免疫組化試劑盒進(jìn)行免疫組化染色實(shí)驗(yàn).首先是烘片，將石蠟切片放置在60℃烘箱中烘片至少60 min，之后在二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理，將脫蠟好的石蠟切片依次完全浸入不同濃度的乙醇中進(jìn)行水化處理，然后使用EDTA修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)，用PBS漂洗修復(fù)好的石蠟切片3次，每次5 min.使用3%的雙氧水完全浸沒(méi)石蠟切片，室溫下避光封閉30 min，再加PBS漂洗石蠟切片3次，每次5 min.使用0.1%PBST配制的5%BSA抗原封閉液，室溫封閉60 min，封閉內(nèi)源性抗原.接著一抗孵育，加適量磷酸化53BP1抗血清（1∶1000）于組織切片上，4℃條件下過(guò)夜，然后用PBS漂洗3次，每次5 min.滴加適量HRP標(biāo)記過(guò)的二抗工作液，室溫孵育60 min.將DAB顯色液滴加至甩干的石蠟組織上，蘇木精復(fù)染，將潤(rùn)洗過(guò)的石蠟切片沒(méi)入蘇木精染液中.之后按下列步驟進(jìn)行組織脫水：70%乙醇5 min，85%乙醇5 min，90%乙醇5 min，95%乙醇5 min，100%乙醇10 min，100%乙醇10 min.最后滴加適量的中性樹(shù)脂封片，掃描石蠟組織切片并保留樣品染色圖像.

1.2.3 免疫組化染色結(jié)果分析

利用Image scope X64軟件采集免疫組化的圖像，應(yīng)用Image-Pro Plus熒光分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析.根據(jù)熒光染色的深淺，即光密度值（OD）以及分布面積大小來(lái)確定目標(biāo)蛋白的量，將圖片上各點(diǎn)的光密度值累加起來(lái)，除以目標(biāo)分布區(qū)域的面積，得到平均光密度值（IOD）.通過(guò)計(jì)算IOD值的大小，對(duì)各樣品的圖像進(jìn)行定量分析.與人工計(jì)數(shù)法相比，該方法不僅能夠提高定量分析的精確度，還可以避免觀察者主觀因素的干擾，重復(fù)性好，可信度高[7].

1.2.4 生物統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）.

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸化53BP1在乳腺癌組織芯片中的免疫組織化學(xué)染色

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，應(yīng)用特異性磷酸化53BP1抗血清對(duì)乳腺癌組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，染色結(jié)果如圖1所示.其中，A1~A8是8例非惡性癌的乳腺組織（non-cancer，NC），其余為220例乳腺癌組織（tumour）.由于A19、F15、F19、I6、K8樣本嚴(yán)重脫片，沒(méi)有采集到滿意圖像，因此這5例病例均未放入結(jié)果統(tǒng)計(jì)范圍中.

圖1 磷酸化53BP1在乳腺癌組織芯片中的免疫組織化學(xué)染色Fig.1 Immunohistochemical staining of phosphorylated 53BP1 in breast cancer tissue microarrays

2.2 磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達(dá)情況的比較

利用Image-Pro Plus分別計(jì)算抗磷酸化53BP1抗體在220個(gè)乳腺癌組織和8例非癌乳腺組織中染色的平均光密度值，IOD大小代表組織標(biāo)本中磷酸化53BP1的表達(dá)量.采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖2（a）所示，磷酸化53BP1在乳腺癌組織標(biāo)本中的平均表達(dá)量為（0.079±0.027），顯著高于非癌乳腺組織標(biāo)本中的平均表達(dá)量（0.036±0.007）.通過(guò)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)證實(shí)，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）.隨機(jī)選取非癌乳腺組織與癌組織染色結(jié)果進(jìn)行比較，如圖2（b）所示，癌組織中目標(biāo)蛋白的棕色顏色更加明顯.

圖2 磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of phosphorylated 53BP1 in breast cancer tissues and non-cancer tissues

2.3 磷酸化53BP1在不同TNM分期乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達(dá)情況的比較

利用上述磷酸化53BP1的染色結(jié)果并結(jié)合病例的TNM分期資料（Ⅰ期的病例數(shù)目為20例，Ⅱ期的病例數(shù)目為141例，Ⅲ期的病例數(shù)目為37例，無(wú)Ⅳ期的病例），分析不同TNM分期中磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達(dá)差異，結(jié)果如圖3（a）所示.選取TNM分期中典型乳腺癌組織與非癌乳腺組織的染色圖片進(jìn)行觀察比較，結(jié)果如圖3（b）所示.磷酸化53BP1在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期癌組織標(biāo)本中的平均表達(dá)量分別為（0.080±0.019）、（0.078±0.025）和（0.084±0.035），在非癌組織標(biāo)本中的平均表達(dá)量為（0.036±0.007）.經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)證實(shí)，磷酸化53BP1在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期癌組織中的平均表達(dá)量均顯著高于非癌組織中的平均表達(dá)量，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）.

圖3 磷酸化53BP1在不同TNM分期乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of phosphorylated 53BP1 in different TNM stages of breast cancer tissues and non-cancer tissues

2.4 磷酸化53BP1在不同病理分級(jí)乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達(dá)情況的比較

乳腺癌組織芯片中組織病理分級(jí)：I級(jí)的病例數(shù)目為7例，Ⅰ-Ⅱ級(jí)的病例數(shù)目為8例，Ⅱ級(jí)的病例數(shù)目為82例，Ⅱ-Ⅲ級(jí)的病例數(shù)目為89例，Ⅲ級(jí)的病例數(shù)目為22例，因Ⅰ級(jí)、Ⅰ-Ⅱ級(jí)的病例數(shù)目較少，將其合并分析.不同病理分級(jí)乳腺癌組織中磷酸化53BP1的表達(dá)與非癌乳腺組織中的表達(dá)差異如圖4（a）所示.選取典型的不同病理分級(jí)乳腺癌組織染色圖像與非癌組織的圖像進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4（b）所示.在Ⅰ和Ⅰ-Ⅱ級(jí)癌組織標(biāo)本中磷酸化53BP1的平均表達(dá)量為（0.072±0.029），在Ⅱ級(jí)癌組織標(biāo)本中表達(dá)量為（0.081±0.023），在Ⅱ-Ⅲ級(jí)癌組織標(biāo)本中的表達(dá)量為（0.079±0.028），在Ⅲ級(jí)癌組織標(biāo)本中的表達(dá)量為（0.082±0.025）；非癌組織中的表達(dá)量為（0.036±0.007）.經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，在Ⅰ和Ⅰ-Ⅱ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅱ-Ⅲ級(jí)和Ⅲ級(jí)癌組織中，磷酸化53BP1的平均表達(dá)量均顯著高于非癌組織中的表達(dá)量，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）.

圖4 磷酸化53BP1在不同病理分級(jí)乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達(dá)Fig.4 Expression of phosphorylated 53BP1 in different pathological grades of breast cancer and non-cancer tissues

2.5 磷酸化53BP1在不同類(lèi)型乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達(dá)情況的比較

按照乳腺癌組織中雌激素受體、孕激素受體、表皮生長(zhǎng)因子2受體等表達(dá)的不同，可將乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A、Luminal B、HER2陽(yáng)性和三陰性乳腺癌，將不符合ER、PR、HER-2表達(dá)檢測(cè)指標(biāo)的乳腺癌患者歸結(jié)為其他類(lèi)型.結(jié)合病歷資料分析可知，220例乳腺癌組織中，Luminal A病例數(shù)目為55例，Luminal B病例數(shù)目為25例，HER2陽(yáng)性病例數(shù)目為48例，三陰性乳腺癌病例數(shù)目為26例，其他類(lèi)型的乳腺癌病例數(shù)目為66例.利用磷酸化53BP1的染色結(jié)果并結(jié)合病例資料，分析不同類(lèi)型的乳腺癌組織與非癌組織中磷酸化53BP1的表達(dá)，結(jié)果如圖5（a）所示.選取典型的不同類(lèi)型乳腺癌組織染色圖片與非癌組織染色圖片進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖5（b）所示.磷酸化53BP1蛋白在Luminal A型、Luminal B型、HER2陽(yáng)性、三陰性以及其他類(lèi)型乳腺癌組織標(biāo)本中的平均表達(dá)量分別為（0.086±0.029）、（0.078±0.028）、（0.077±0.020）、（0.079±0.031）、（0.074±0.027）；在非癌組織中的平均表達(dá)量為（0.036±0.007）.經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)證實(shí)，磷酸化53BP1在不同類(lèi)型的乳腺癌組織中的表達(dá)量均顯著高于非癌組織中的表達(dá)量，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）.

圖5 磷酸化53BP1在不同類(lèi)型乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of phosphorylated 53BP1 in different types of breast cancer tissues and non-cancer tissues

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞在生長(zhǎng)增殖等正常生命活動(dòng)過(guò)程中，常常發(fā)生遺傳物質(zhì)DNA的雙鏈斷裂損傷（DSB）.如果DSB不能正常修復(fù)，除引起細(xì)胞死亡外，還可能引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展.真核細(xì)胞有2種主要的修復(fù)途徑應(yīng)對(duì)DSB損傷：同源重組修復(fù)（homologous recombination，HR）和非同源末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）.HR需要同源DNA序列作為模板進(jìn)行修復(fù)，而NHEJ直接連接被切斷的DNA受損的末端[8].當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DSB時(shí)，在DNA損傷位點(diǎn)處蛋白激酶ATM被活化，進(jìn)而使聚集在此區(qū)域的53BP1發(fā)生磷酸化.磷酸化的53BP1與RIF1結(jié)合形成復(fù)合物聚集在DSB處，抑制細(xì)胞進(jìn)行同源重組修復(fù)[9].此時(shí)，乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）通過(guò)激活下游底物PP4C（protein phosphatase 4 catalytic subunit）等促進(jìn)磷酸化的53BP1發(fā)生去磷酸化.去磷酸化的53BP1蛋白與RIF1分離，促使斷裂的DNA以未損傷的姐妹染色單體的同源序列作為修復(fù)模板，進(jìn)行DNA同源重組修復(fù)，最終保證細(xì)胞基因組的完整性[10].如果由各種原因?qū)е翫SB位點(diǎn)的53BP1持續(xù)處于磷酸化狀態(tài)，將抑制細(xì)胞同源重組修復(fù)的正常進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，引起腫瘤發(fā)生.

本研究通過(guò)對(duì)220例乳腺癌組織中53BP1蛋白的磷酸化水平進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，利用Image-Pro Plus熒光分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)磷酸化53BP1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于非癌對(duì)照乳腺組織中的表達(dá)水平，在不同TNM分期、病理分級(jí)以及不同類(lèi)型的乳腺癌組織中的平均表達(dá)量均顯著高于非癌對(duì)照乳腺組織中的表達(dá)量（P＜0.001）.這些結(jié)果表明，磷酸化53BP1與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是一個(gè)潛在的能反映乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)志物，可應(yīng)用于早期乳腺癌的篩查和診斷.