郭子仙，解 偉，任北妮，段 虎，高美榮，隋麗英

(天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的優(yōu)良對蝦品種，2019年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到496.72萬噸，我國凡納濱對蝦產(chǎn)量達(dá)到181.55萬 噸[1–2]．近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境惡化和種質(zhì)退化等問題導(dǎo)致疾病頻繁發(fā)生，使凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3]．對蝦擁有開放循環(huán)系統(tǒng)，極易受到養(yǎng)殖水體環(huán)境的影響，而環(huán)境脅迫造成的應(yīng)激對對蝦機(jī)體抗氧化和免疫系統(tǒng)造成損傷[4]．將功能性添加劑如益生菌、抗菌肽等應(yīng)用于凡納濱對蝦養(yǎng)殖是提高對蝦免疫力、促進(jìn)對蝦生長的重要途徑[5-7]．

古菌幾乎能適應(yīng)地球上所有極端環(huán)境，古菌細(xì)胞可積累相容性溶質(zhì)、表層蛋白、類胡蘿卜素等多種生物活性物質(zhì)[8–9]．鹽富饒菌(Haloferax)是在高鹽環(huán)境下生長的古菌屬，具有生長快、耐鹽范圍廣和代謝功能強(qiáng)等特點(diǎn)，因富含菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素等類胡蘿卜素而呈紅色[10]．菌紅素是一種長鏈C50類胡蘿卜素，包含13對共軛雙鍵，且末端含有羥基，是一種有效的自由基清除劑，具有較高的DPPH自由基清除能力，其抗氧化能力高于β–胡蘿卜素[11–13]. 研究表明，類胡蘿卜素能提高水產(chǎn)動物的經(jīng)濟(jì)性狀和品質(zhì)．富含類胡蘿卜素的飼料能夠促進(jìn)虹鱒魚(On-corhynchus mykiss)生長，提高色素含量[14]. 向黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)投喂含β–胡蘿卜素的飼料可提高其肝臟中抗氧化酶活性和熱休克蛋白HSP70基因的表達(dá)，進(jìn)而降低由高溫脅迫和病原菌感染造成的死亡率[15]．但古菌及其類胡蘿卜素作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖乃至畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用未見報道．

鹵蟲是海水苗種培育重要的生物餌料．作為非選擇性濾食生物，鹵蟲可高效濾食單胞藻、細(xì)菌和微小的有機(jī)碎屑等．水產(chǎn)育苗中常采用強(qiáng)化方式使鹵蟲腸道包裹攜帶營養(yǎng)強(qiáng)化劑(如魚油)和藥物等，通過投喂強(qiáng)化鹵蟲將其有效送達(dá)水產(chǎn)苗種體內(nèi)．本研究將古菌Haloferax作為添加劑，通過鹵蟲強(qiáng)化的方式將其投喂給凡納濱對蝦仔蝦，從生長性能、腸道菌群組成和抗逆性等方面探討其對凡納濱對蝦的影響．

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵培養(yǎng)

鹽富饒菌菌株HaloferaxYC-6分離于天津漢沽鹽場結(jié)晶池鹵水，將其接種于培養(yǎng)基(7.5g/L酸水解酪蛋白，10g/L酵母提取物，100g/L稀釋鹵水)，150r/min、37℃和光照(2000lx)條件下?lián)u瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期獲得種子液．添加5g/L蔗糖于上述培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵體積為3L．發(fā)酵條件：pH 5.5～8.5，溫度37℃，初始攪拌速度200r/min，每24h升高100r/min直到400r/min．發(fā)酵5d后8000r/min離心10min收集菌體，4℃避光保存．

1.2 鹵蟲強(qiáng)化

將美國大鹽湖鹵蟲卵(比利時INVE公司)在28℃和鹽度30g/L稀釋鹵水中連續(xù)充氣孵化，24h后收集鹵蟲無節(jié)幼體，轉(zhuǎn)移至鹽度50g/L稀釋鹵水中，以HaloferaxYC-6菌體強(qiáng)化鹵蟲．鹵蟲密度為200mL-1，菌體投加量(以干質(zhì)量計(jì))為0.3g/L．強(qiáng)化12h后收集鹵蟲，用相同鹽度的稀釋鹵水沖洗，4℃充氣保存，以維持鹵蟲存活和營養(yǎng)質(zhì)量．

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)所用凡納濱對蝦仔蝦購自河北鑫海生物技術(shù)公司．將PL5仔蝦在28℃、鹽度20g/L稀釋鹵水中暫養(yǎng)3d，暫養(yǎng)過程中投喂蝦片飼料．

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選出活力好且大小均勻的蝦苗(平均體長0.53cm)隨機(jī)分為2組，分別以饑餓12h鹵蟲和Haloferax菌體強(qiáng)化12h鹵蟲作為對照組和實(shí)驗(yàn)組，投喂凡納濱對蝦．饑餓鹵蟲和Haloferax強(qiáng)化鹵蟲的營養(yǎng)組成(以干質(zhì)量計(jì))見表1．

表1 饑餓鹵蟲和Haloferax強(qiáng)化鹵蟲的營養(yǎng)組成 Tab. 1 Nutrient composition of starved and Haloferaxenriched Artemia

養(yǎng)殖在循環(huán)過濾養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，用海綿過濾食物殘?jiān)蛯ξr糞便．養(yǎng)殖箱為長方形聚丙烯箱體(48cm×26cm×39cm)，每組設(shè)3個平行，每個平行箱投放蝦苗1000尾，單位養(yǎng)殖水體為20L．養(yǎng)殖期間每天投喂3次，每尾蝦每次的初始投喂量為100個鹵蟲，投喂量按前一天的10%增加．養(yǎng)殖周期為10d，從第6天開始每天換1/3的水．養(yǎng)殖水體鹽度為20g/L，水溫(28±1.0)℃，溶氧量(5.5±0.5)mg/L，pH 7.6±0.2，連續(xù)充氣，光/暗周期為16h/8h．

1.5 樣品采集與指標(biāo)分析

1.5.1 腸道菌群分析

養(yǎng)殖結(jié)束后測定對蝦存活率，并從每個平行箱中隨機(jī)取10尾蝦測量體長(自對蝦眼柄基部至尾節(jié)末端的長度)．從每個平行箱取5尾饑餓24h的對蝦，置于冰上麻醉，無菌條件下解剖取出對蝦腸道，立即放入滅菌的EP管中液氮速凍，置于－80℃保存．將樣品反復(fù)凍融后勻漿，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)提取腸道菌群DNA，樣品交予諾禾致源公司使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量檢測文庫合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序．使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)Shannon、辛普森多樣性指數(shù)Simpson、ACE指數(shù)和覆蓋率Good-coverage指數(shù)．

1.5.2 對蝦粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸測定

將收集的鹵蟲和對蝦進(jìn)行冷凍干燥(BTP-3ES型冷凍干燥機(jī)，美國SP-Scientific公司)．稱取0.05g冷凍干燥樣品，參照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定·凱氏定氮法》，利用Kjeltec–8400型全自動凱式定氮儀(丹麥FOOS公司)測定對蝦粗蛋白質(zhì)含量．稱取0.2g冷凍干燥樣品，參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·食品中脂肪的測定》，用索氏抽提法測定對蝦粗脂肪含量．稱取0.04g冷凍干燥樣品，準(zhǔn)確加入1mg內(nèi)標(biāo)液(C20∶2n-6，美國NUCHEK PREP公司)，向混合物中加入5mL甲醇與甲苯混合物(體積比為3∶2)和5mL氯乙酰與甲醇混合物(體積比為1∶20)，充分勻漿(T18型勻漿機(jī)，德國IKA公司)后，沸水浴1h．用正己烷萃取脂肪酸甲酯并濃縮[16]，利用GC–2014型氣相色譜儀(日本島津公司)進(jìn)行脂肪酸定性和定量測定．

1.5.3 弧菌攻毒實(shí)驗(yàn)

副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus MCCC 1A10122)購于海洋微生物菌種保藏管理中心(https:// mccc.org.cn/)．菌種在28℃、150r/min條件下于2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期．養(yǎng)殖結(jié)束后每缸隨機(jī)取出20尾蝦，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以弧菌108mL-1劑量浸浴攻毒48h，每隔24h測定對蝦存活率．

1.5.4 氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)

每個平行箱中隨機(jī)各取出20尾蝦，置于1L含30mg/L氯化銨、鹽度20g/L的水體中．溶液中非離子氨(NH3-N)質(zhì)量濃度為0.8mg/L[17]．每隔24h測定對蝦存活率．

1.5.5 對蝦肝胰腺抗氧化酶活性

養(yǎng)殖結(jié)束后和氨氮脅迫后，在無菌條件下解剖獲得對蝦肝胰腺，用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定其過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量．

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS statistics analysis 20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，*表示有顯著差異(P＜0.05)．

2 結(jié)果與分析

2.1 凡納濱對蝦仔蝦存活和生長

投喂Haloferax強(qiáng)化的鹵蟲對凡納濱對蝦仔蝦存活和生長的影響見表2．投喂Haloferax強(qiáng)化鹵蟲的實(shí)驗(yàn)組對蝦的存活率和體長均顯著高于對照組(P＜0.05)．

表2 投喂Haloferax強(qiáng)化的鹵蟲對凡納濱對蝦仔蝦存活和生長的影響 Tab. 2 Effect of Haloferax-enriched Artemiafeeding on the survival and growth of L. vannamei postlarvae

2.2 凡納濱對蝦營養(yǎng)組成

不同組別凡納濱對蝦營養(yǎng)組成見表3．兩組對蝦粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量均無顯著性差異．實(shí)驗(yàn)組的C14∶1n-5、C18∶0、C18∶1n-9＋n-7和C18∶4含量顯著低于對照組(P＜0.05)，其他脂肪酸含量均無顯著性差異．

表3 不同組別凡納濱對蝦營養(yǎng)組成 Tab. 3 Nutritional composition of L. vannamei in different groups

2.3 凡納濱對蝦腸道菌群多樣性

不同組別凡納濱對蝦腸道微生物α 多樣性見表4．對照組和實(shí)驗(yàn)組的Good-coverage覆蓋率值均為0.99，表明每個文庫的16S rRNA基因代表了對蝦腸道中的大多數(shù)細(xì)菌．實(shí)驗(yàn)組對蝦腸道微生物多樣性指數(shù)均有所上升，但與對照組沒有顯著差異(P＞0.05)．

表4 不同組別凡納濱對蝦腸道微生物α 多樣性 Tab. 4 Alfa-diversity of intestinal microbiota of L.vannamei postlarvae in different groups

凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)門水平變化如圖1(a)所示，對蝦腸道菌群主要以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)為主．與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組變形菌門和放線菌門的相對豐度有所下降，厚壁菌門和擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度提高．凡納濱對蝦腸道菌群屬水平變化如圖1(b)所示，實(shí)驗(yàn)組弧菌屬(Vibro)比例下降，副球菌屬(Paracoccus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、微小桿菌屬(Acteroides)和乳桿菌屬(Lactobacillus)的相對豐度均有所上升．

圖1 投喂Haloferax強(qiáng)化鹵蟲對凡納濱對蝦腸道菌群門和屬水平的影響 Fig. 1 Effect of Haloferax-enriched Artemiafeeding on the intestinal microbiota of L. vannameipostlarvae in phylum level and in genus level

2.4 凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化能力

投喂Haloferax強(qiáng)化鹵蟲對對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響結(jié)果見表5．與對照組相比，養(yǎng)殖結(jié)束后實(shí)驗(yàn)組對蝦肝胰腺SOD活性有所上升，但沒有顯著性差異．實(shí)驗(yàn)組對蝦肝胰腺CAT活性顯著高于對照組(P＜0.05)，MDA含量顯著低于對照組(P＜0.05)．

表5 投喂Haloferax強(qiáng)化鹵蟲對對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響 Tab. 5 Effect of Haloferax-enriched Artemiafeeding on antioxidative capacity of L. vannamei postlarvae

2.5 凡納濱對蝦抗脅迫能力

2.5.1 氨氮脅迫

氨氮脅迫對凡納濱對蝦存活率的影響如圖2所示．24h 對照組和實(shí)驗(yàn)組對蝦存活率沒有顯著差異，但氨氮脅迫48h后，實(shí)驗(yàn)組存活率顯著高于對照組(P＜0.05)．

圖2 氨氮脅迫對凡納濱對蝦存活率的影響 Fig. 2 Effect of ammonia nitrogen on survival rate of L. vannamei

投喂Haloferax強(qiáng)化的鹵蟲對氨氮脅迫48h后對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響結(jié)果見表6．氨氮脅迫48h后，實(shí)驗(yàn)組對蝦肝胰腺SOD活性有所降低，但差異不顯著(P＞0.05)，CAT活性和MDA含量顯著降低(P＜0.05)．

表6 投喂Haloferax強(qiáng)化鹵蟲對氨氮脅迫48h后對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響 Tab. 6 Effect of Haloferax-enriched Artemia feeding on antioxidative capacity of L.vannamei postlarvae after being exposed to ammonia nitrogen for 48 h

2.5.2 副溶血弧菌攻毒

副溶血弧菌攻毒對凡納濱對蝦存活率的影響如圖3所示．攻毒24h的對照組和實(shí)驗(yàn)組對蝦存活率沒有顯著差異，在91.67%～93.33%之間．攻毒48h后，實(shí)驗(yàn)組對蝦存活率顯著高于對照組(P＜0.05)．

圖3 副溶血弧菌攻毒對凡納濱對蝦存活率的影響 Fig. 3 Effect of challenge with V. parahaemolyticus on survival rate of L. vannamei

3 討 論

3.1 Haloferax對凡納濱對蝦生長和營養(yǎng)組成的影響

本文研究結(jié)果表明，投喂Haloferax強(qiáng)化鹵蟲能顯著提高對蝦仔蝦的存活率，促進(jìn)對蝦生長．有研 究[15,18]表明，飼料中類胡蘿卜素的添加起到促進(jìn)水產(chǎn)動物生長和提高抗逆能力的作用．Haloferax對對蝦的促進(jìn)作用可能與細(xì)胞膜上大量積累的類胡蘿卜素有關(guān)．

本研究中強(qiáng)化鹵蟲的各種脂肪酸含量較饑餓鹵蟲高，與鹵蟲在饑餓狀態(tài)下代謝脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)為其提供生長存活必需的能量有關(guān)．一般而言，n-3多不飽和脂肪酸特別是高不飽和脂肪酸(如EPA、ARA和DHA)對海洋水產(chǎn)動物細(xì)胞膜的流動性和滲透性有較大影響[16,19]．對照組對蝦中C14∶1n-5、C18∶0、 C18∶1n-9＋n-7和C18∶4含量顯著高于實(shí)驗(yàn)組，可能與對蝦本身的脂肪酸組成和對餌料中脂肪酸的選擇性代謝有關(guān)．

3.2 Haloferax對凡納濱對蝦腸道菌群的影響

腸道菌群對對蝦維持機(jī)體健康和免疫穩(wěn)態(tài)非常重要[20]．本研究中Haloferax的添加在一定程度上增加了對蝦腸道菌群的多樣性，同時Haloferax的攝入降低了變形菌門豐度，主要表現(xiàn)在弧菌屬的豐度降低. 變形菌門廣泛存在于水生無脊椎動物腸道微生物群中，通常是甲殼類動物腸道菌群的主要組成部分[21]. 弧菌是對蝦腸道的優(yōu)勢菌屬，部分弧菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶有助于其在腸道菌群形成優(yōu)勢菌，與宿主共存[22]. 但弧菌屬于條件致病菌，其數(shù)量和毒力與環(huán)境因子有關(guān)，環(huán)境脅迫造成弧菌的數(shù)量和毒力增加，進(jìn)而致病性增強(qiáng)，導(dǎo)致對蝦的死亡率較高[23-24]．本研究中Haloferax的添加在一定程度上降低了弧菌屬的豐度，提高了乳桿菌屬的豐度，對對蝦腸道健康起到有益作用．

3.3 Haloferax對凡納濱對蝦抗氨氮脅迫能力的影響

古菌細(xì)胞膜中含有大量菌紅素等長鏈C50類胡蘿卜素[10]．與β–類胡蘿卜素相比，Haloferax類胡蘿卜素提取物可更有效地清除DPPH自由基，并對H2O2介導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血具有更好的保護(hù)作用[25]．研究[15,26]表明，類胡蘿卜素的添加對水生動物產(chǎn)生積極的效果，改善由養(yǎng)殖密度過高、高溫脅迫或病原菌感染造成的不良影響．在脊椎動物中，類胡蘿卜素發(fā)揮了其抗氧化和免疫作用，可以清除過量自由基從而降低自我損傷[27]．類胡蘿卜素也被證實(shí)能夠提高甲殼動物免疫力和抗氧化能力[28-29]．

氨氮是影響對蝦存活和生長的重要環(huán)境因子. 當(dāng)暴露于高濃度氨氮時，對蝦機(jī)體發(fā)生一系列改變，包括肝胰腺損傷、細(xì)胞凋亡以及免疫損傷等[30-31]．轉(zhuǎn)錄組分析[32]表明，氨氮暴露破壞對蝦氧化和抗氧化平衡，造成機(jī)體的氧化應(yīng)激．機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)包括兩類：酶類(如SOD和CAT等)和小分子非酶類(如谷胱甘肽、類胡蘿卜素和維生素等)．研究[33]表明，對蝦CAT、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶在對蝦氨氮防御中發(fā)揮重要作用．本研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖過程中Haloferax的添加使對蝦肝胰腺抗氧化酶活力上升，其中CAT活性顯著增加．氨氮脅迫48h后，實(shí)驗(yàn)組對蝦的存活率顯著高于對照組，表明古菌提高了對蝦抵抗氨氮脅迫的能力，與古菌的攝入提高了對蝦抗氧化酶活性進(jìn)而發(fā)揮了氨氮防御功能有關(guān)．值得一提的是，氨氮脅迫后實(shí)驗(yàn)組對蝦肝胰腺SOD活性有所下降，CAT活性和MDA含量顯著降低，可能與機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的反應(yīng)機(jī)理有關(guān)．在抗氧化系統(tǒng)中，SOD作為清除活性氧和自由基的第一道防線，能將活性氧轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣，然后過氧化氫通過CAT作用轉(zhuǎn)化為水和氧氣．MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以作為細(xì)胞膜氧化損傷的標(biāo)志[34]．本研究中氨氮脅迫后實(shí)驗(yàn)組MDA含量顯著降低，表明實(shí)驗(yàn)組對蝦機(jī)體氧化損傷程度較輕，而CAT活性降低可能是因?yàn)镠aloferax提供的類胡蘿卜素代替抗氧化酶發(fā)揮了清除活性氧和自由基的功能，進(jìn)而保護(hù)對蝦免受氧化應(yīng)激損傷．

3.4 Haloferax對凡納濱對蝦抗弧菌能力的影響

副溶血弧菌是對蝦急性肝胰腺壞死綜合征(acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNS)的主要病原體．除損傷肝胰腺外，弧菌感染還可損傷對蝦腸道的屏障功能，造成對蝦感染和死亡[35]．本研究中Haloferax的添加提升了凡納濱對蝦對弧菌的抵抗能力，顯著提高了其存活率．其原因一方面可能是Haloferax的攝入降低了對蝦腸道內(nèi)弧菌屬的豐度，緩解了弧菌感染的程度；另一方面可能與Haloferax含有的活性物質(zhì)有關(guān)．由于對高鹽環(huán)境的適應(yīng)性，嗜鹽古菌產(chǎn)生具有生物活性的初級和次級代謝產(chǎn)物，如酶類、類胡蘿卜素、PHB以及嗜鹽菌素等[9,36-38]，這些物質(zhì)可能成為對蝦抗弧菌感染的貢獻(xiàn)者．

4 結(jié) 論

將古菌Haloferax作為飼料添加劑通過鹵蟲強(qiáng)化方式投喂給凡納濱對蝦仔蝦，可以促進(jìn)對蝦的存活和生長，改善對蝦腸道菌群，增強(qiáng)對蝦抵抗弧菌和抗氨氮脅迫能力．Haloferax菌體富含大量高抗氧化活性的C50類胡蘿卜素，從而提高對蝦機(jī)體抗氧化能力，增強(qiáng)對蝦對弧菌的抵抗力．本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究古菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供了依據(jù)．