劉曉楠, 趙素娟, 王 博, 王宏鑫, 郝陽光

(沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院, 沈陽 110034)

果蠅Drosophila的造血發(fā)生在兩個階段，首先在胚胎時期的頭部中胚層主要由漿細胞及少量晶細胞，這些細胞一部分以游離形式存在于幼蟲時期血淋巴中，另一部分以附著血細胞的形式存儲在體腔表皮下層的造血袋中(Evansetal., 2003; Hartenstein, 2006; Makhijanietal., 2011)；第2次造血發(fā)生在淋巴腺中，淋巴腺是幼蟲時期的造血器官，主要由CZ區(qū)(cortical zone)的漿細胞、晶細胞，MZ區(qū)(medullary zone)的前體血細胞及少量的PSC區(qū)(posterior signaling center)細胞構成(Gold and Brückner, 2015; Vlisidou and Wood, 2015)。淋巴腺在果蠅3齡幼蟲末期開始裂解并釋放成熟的血細胞到血淋巴中(Vlisidou and Wood, 2015)。薄層細胞也屬于果蠅成熟血細胞的一種，但只有當果蠅受到感染或損傷時才會產生(Sorrentinoetal., 2002; Krzemienetal., 2010)。

PIWI蛋白是ARGONAUTE/PIWI蛋白家族的一個亞家族，主要參與由小非編碼RNA介導的基因調控，尤其可與PIWI相互作用RNA (PIWI-interacting RNAs, piRNAs)以復合體的形式參與在表觀遺傳學、轉錄后及翻譯水平的基因調控及轉座子沉默(Julianoetal., 2011)。PIWI蛋白存在較廣泛，在人類、小鼠及果蠅等多種生物中都有發(fā)現(xiàn)，果蠅中PIWI蛋白家族包含Piwi, Aubergine (Aub)及Argonaute 3 (Ago3) 3種。PIWI/piRNA介導的DNA甲基化、組蛋白甲基化、乙酰化等表觀遺傳學調控對維持生殖細胞正常發(fā)育具有重要作用，果蠅PIWI蛋白的缺失可導致雌性或雄性不育(Coxetal., 1998; Schmidtetal., 1999; Kirinoetal., 2009)。母體遺傳的Piwi, Aub及Ago3在早期胚胎發(fā)生中可維持正常的染色體結構及細胞周期(Manietal., 2014)。此外，研究發(fā)現(xiàn)PIWI蛋白在果蠅腦中也有少量表達，蘑菇體αβ神經(jīng)元中的Aub和Ago3參與長期記憶的形成，PIWI蛋白這種低水平的表達有利于轉座子在αβ神經(jīng)元中的活化，進而產生基因組異質性，可利于個體間大腦功能及行為的變異(Perratetal., 2013)。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)piwi基因在果蠅幼蟲游離血細胞中表達且Jumu轉錄因子可調控其轉錄(Haoetal., 2018)，而Piwi蛋白在造血中的功能研究鮮有報道。本研究以黑腹果蠅Drosophilamelanogaster為實驗材料，首先利用免疫熒光染色方法檢測Piwi蛋白在果蠅血細胞及造血器官中的表達及定位，并利用RNAi技術在血細胞及淋巴腺組織中特異性敲低piwi基因，檢測piwi對果蠅血細胞增殖及分化的影響，為深入理解該基因在造血作用中的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 黑腹果蠅品系

野生型黑腹果蠅w1118,e33C-Gal4和Hml-Gal4-UAS-2×EGFP均為東北林業(yè)大學金麗華教授惠贈;UAS-piwiRNAi(v101658)購自ViennaDrosophilaRNAi Center(VDRC)。e33C-Gal4在所有血細胞中都表達，在本研究中利用該品系在黑腹果蠅游離血細胞及整個淋巴腺中敲低piwi基因；Hml-Gal4-UAS-2×EGFP在游離、附著血細胞及淋巴腺的CZ區(qū)表達，在本研究中利用該品系在黑腹果蠅游離血細胞及附著血細胞中敲低piwi基因(Kulkarnietal., 2011; Makhijanietal., 2011)。所有品系均在標準的玉米酵母培養(yǎng)基中飼養(yǎng)，光周期為12L∶12D，其中w1118品系在25℃培養(yǎng)，本實驗所用雜交品系在29℃培養(yǎng)。本實驗中雜交品系包括：e33C-Gal4分別與w1118及UAS-piwiRNAi(v101658)雜交，子一代基因型分別為e33C-Gal4/+(對照組)及e33C>piwiRNAi；Hml-Gal4-UAS-2×EGFP分別與w1118及UAS-piwiRNAi(v101658)雜交，子一代基因型分別為Hml>GFP/+(對照組)及Hml>GFP>piwiRNAi。

1.2 Piwi蛋白在黑腹果蠅游離血細胞及淋巴腺中免疫熒光染色定位

為探討Piwi在造血中的功能，利用Piwi抗體檢測Piwi蛋白在果蠅游離血細胞及淋巴腺中的表達及定位。在預冷的PBS中剝離黑腹果蠅w1118、及雜交品系e33C-Gal4/+與e33C>piwiRNAi的3齡中后期幼蟲(產卵后約96 h)表皮提取淋巴腺或游離血細胞，將淋巴腺置于EP管中進行固定，游離血細胞需轉移至粘附性載玻片并靜止30 min，3.7%的甲醛溶液固定15 min，并用PBST(含0.1% Tween-20的PBS溶液)進行沖洗，5%羊血清進行封閉30 min，加入一抗mouse anti-Piwi(1∶100) (受贈于日本東京大學Mikiko C. Siomi教授)，將樣品置于冰箱，4℃過夜，加入熒光二抗 Alexa Fluor488或Alexa Fluor 568標記的Goat anti-Mouse IgG(1∶100)(Invitrogen, Molecular Probes)結合2 h，DAPI (1∶500)(Invitrogen, Molecular Probes)結合10 min，用封片劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 免疫熒光染色檢測黑腹果蠅游離血細胞及淋巴腺血細胞增殖及形態(tài)變化

利用PH3 (標記細胞有絲分裂M期)及α-tubulin(標記細胞骨架及有絲分裂時期紡錘體的形成)抗體染色分別檢測黑腹果蠅雜交品系e33C-Gal4/+與e33C>piwiRNAi(e33C>piwiRNAi可實現(xiàn)在整個淋巴腺及游離血細胞中敲低piwi基因的表達)的3齡中后期幼蟲的游離血細胞和淋巴腺血細胞增殖及形態(tài)變化；利用P1(漿細胞的標簽蛋白NimC1)及L1(薄層細胞標簽蛋白)抗體染色分別檢測雜交品系e33C-Gal4/+,e33C>piwiRNAi,Hml>GFP/+及Hml>GFP>piwiRNAi的3齡中后期幼蟲淋巴腺和游離血細胞漿細胞及薄層細胞的分化情況，免疫熒光染色方法同1.2節(jié)，所用抗體包括： mouse anti-P1及mouse anti-L1抗體(1∶50) (受贈于匈牙利科學院遺傳生物學研究中心研究所I. Ando教授)，mouse anti-α-tubulin 抗體(1∶100)(Sigma)；rabbit anti-PH3抗體(1∶200)(Millipore)。

1.4 黑腹果蠅游離血細胞及附著血細胞數(shù)量檢測

游離血細胞計數(shù)：將黑腹果蠅雜交品系e33C-Gal4/+或e33C>piwiRNAi的5頭3齡中后期幼蟲置于20 μL PBS中，并用鑷子將表皮撕開，使游離血細胞溶于PBS并轉移至血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，每種品系至少進行10次重復。附著血細胞計數(shù)：將黑腹果蠅Hml>GFP/+或Hml>GFP>piwiRNAi的20頭3齡中后期幼蟲置于-20℃冰箱冷凍10 min，背部朝上放置在載玻片上，并在熒光顯微鏡下觀察并照相，利用ImageJ軟件統(tǒng)計每頭幼蟲背部的血細胞熒光總面積，每種品系采集的幼蟲不少于20頭，并進行3次重復。

1.5 圖像分析及定量

所有用于定量的圖像均由萊卡熒光顯微鏡采集，并用ImageJ軟件進行分析。對于游離血細胞中PH3陽性細胞比例，Piwi及P1的蛋白強度的定量，每種品系至少采集10張照片進行統(tǒng)計；游離血細胞中Piwi及P1的蛋白熒光強度為細胞中總熒光信號強度/細胞面積(OD/pixel)。對于淋巴腺中PH3陽性細胞數(shù)量是指每片淋巴腺第1葉片上所有PH3陽性細胞的數(shù)量，淋巴腺中Piwi信號強度指淋巴腺第1葉片總Piwi熒光強度/淋巴腺第1葉片的面積(mm2)，淋巴腺 P1陽性細胞比例指P1陽性細胞面積占整個淋巴腺面積的百分比，每組采集的淋巴腺不少于20個，所有定量分析均進行3次生物學重復。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析，結果均表示為平均值±標準差，組間差異采用t檢驗。

2 結果

2.1 Piwi蛋白在黑腹果蠅游離血細胞中的表達及定位

結果顯示，Piwi在野生型黑腹果蠅w1118游離血細胞中有較高水平的表達，且主要定位在細胞質中(圖1: A-C)。與對照組e33C-Gal4/+(圖1: D-F)相比，e33C>piwiRNAi游離血細胞中Piwi蛋白水平明顯降低，表明e33C>piwiRNAi成功實現(xiàn)了在血細胞中特異敲低piwi的表達(圖1: D-J)。

2.2 敲低piwi基因對黑腹果蠅游離血細胞增殖及分化的影響

血細胞計數(shù)結果顯示，與對照e33C-Gal4/+(游離血細胞數(shù)量1 640±174.1個)相比，e33C>piwiRNAi游離血細胞數(shù)量(3 827±256.9個)顯著增加(P<0.001)(圖2: M)。由于Hml-Gal4-UAS-2×EGFP品系攜帶GFP蛋白可直接標記血細胞，因此我們利用該Gal4品系檢測了piwi基因表達水平降低對果蠅幼蟲附著血細胞數(shù)量的影響。結果顯示，Hml>GFP>piwiRNAi幼蟲附著血細胞數(shù)量與對照Hml>GFP/+相比未出現(xiàn)顯著差異(圖2: A, B, N)。

為進一步分析敲低piwi基因對游離血細胞增殖的影響，我們利用PH3抗體檢測游離血細胞中處于有絲分裂M期的細胞數(shù)量。結果顯示，與對照e33C-Gal4/+(0.7459%±0.091%)相比，e33C>piwiRNAi游離血細胞中PH3陽性細胞比例(3.336%±0.565%)顯著增加(P<0.001) (圖2: C, D, O)。同時，α-tubulin染色結果顯示e33C>piwiRNAi游離血細胞在有絲分裂M期時可形成正常的紡錘體且細胞形態(tài)與對照相比無顯著差異(圖2: C, D)。

為分析敲低piwi基因對游離血細胞分化的影響，利用P1及L1抗體分別檢測漿細胞及薄層細胞的分化情況，結果顯示，Hml>GFP>piwiRNAi游離血細胞中漿細胞的標簽蛋白NimC1(P1抗體標記)的表達與對照組Hml>GFP/+相比未出現(xiàn)顯著變化(圖2: E-H, P)，且敲低piwi基因未引起薄層細胞(L1陽性細胞)的產生(圖2: I-L)。

此外，我們還檢測了e33C>piwiRNAi游離血細胞的分化情況，與Hml>GFP>piwiRNAi結果一致，未見異常分化(結果未顯示)。

圖1 Piwi蛋白在黑腹果蠅游離血細胞中的表達及定位Fig. 1 Expression and localization of Piwi protein in circulating hemocytes of Drosophila melanogasterA-I: 分別為野生型w1118(A-C)、對照e33C-Gal4/+基因型(D-F)及e33C>piwi RNAi基因型(G-I)血細胞Piwi信號檢測 Piwi expression in the wild type w1118 (A-C), control e33C-Gal4/+ (D-F) and e33C>piwi RNAi (G-I) circulating hemocytes, respectively. e33C-Gal4分別與w1118及UAS-piwi RNAi(v101658)雜交，子一代基因型分別為e33C-Gal4/+及e33C>piwi RNAi；下同。e33C-Gal4 crossed with w1118 and UAS-piwi RNAi (v101658), and the genotypes of the first filial generation were e33C-GAL4/+ and e33C>piwi RNAi, respectively. The same below. A, D, G: Piwi抗體染色Piwi antibody staining; B, E, H: DAPI染色DAPI staining; C, F, I: 分別為前兩圖的疊加圖Merge of the former two pictures, respectively. J: Piwi在游離血細胞中平均熒光強度Mean fluorescence intensity of Piwi in circulating hemocytes. ***P<0.001; ns無顯著差異No significant difference (P>0.05)(t檢驗t-test).

圖2 敲低piwi基因對黑腹果蠅游離血細胞增殖及分化的影響Fig. 2 Effect of piwi knock-down on the proliferation and differentiation of circulating hemocytes of Drosophila melanogasterHml-Gal4-UAS-2×EGFP分別與w1118及UAS-piwi RNAi(v101658)雜交，子一代基因型分別為Hml>GFP/+(對照組)及Hml>GFP>piwi RNA。Hml-Gal4-UAS-2×EGFP crossed with w1118 and UAS-piwi RNAi (v101658), and the genotypes of the first filial generation were Hml>GFP/+ (the control group) and Hml>GFP>piwi RNAi, respectively. A-B: GFP標記附著血細胞 GFP-labeled sessile hemocytes; C-D: α-tubulin, PH3與DAPI疊加圖Merge of α-tubulin, PH3 and DAPI; E, G: P1抗體(漿細胞的標簽蛋白NimC1)染色P1 antibody (plasmatocyte marker protein NimC1) staining; F, H: P1抗體染色與GFP疊加圖Overlay of P1 antibody staining and GFP; I, K: L1抗體(薄層細胞標簽蛋白)染色L1 antibody (lamellocyte marker protein) staining; J, L: L1抗體染色與GFP疊加圖Merge of L1 antibody staining and GFP. M: 血細胞計數(shù)Hemocyte count; N: 每幼蟲GFP熒光面積GFP fluorescence area/larva; O: 游離血細胞中PH3陽性細胞比例Proportion of PH3+ cells in circulating hemocytes; P: P1平均熒光強度Mean fluorescence intensity of P1. ***P<0.001; ns無顯著差異No significant difference (P>0.05) (t檢驗t-test).

2.3 敲低piwi基因對黑腹果蠅淋巴腺血細胞增殖的影響

淋巴腺是果蠅幼蟲時期重要的造血器官，為進一步分析piwi基因在果蠅造血中的作用，我們利用Piwi抗體檢測Piwi在黑腹果蠅淋巴腺中表達及定位。結果顯示，Piwi在整個淋巴腺都有表達，在各區(qū)域的表達水平基本一致，且主要定位在淋巴腺血細胞的細胞質中(圖3: A-D)。由于2.2節(jié)結果顯示敲低piwi基因可引起游離血細胞過度增殖，有絲分裂M期的血細胞數(shù)量明顯增加，因此利用PH3抗體進一步檢測e33C>piwiRNAi淋巴腺血細胞增殖情況。結果顯示，與對照e33C-Gal4/+相比，e33C>piwiRNAi淋巴腺中Piwi蛋白的表達顯著降低(P<0.001) (圖3: E, F, K)，但PH3陽性細胞的比例未顯著增加，且淋巴腺也未出現(xiàn)明顯增大(圖3: G-J, L, M)。

2.4 敲低piwi基因對黑腹果蠅淋巴腺血細胞分化的影響

為分析敲低piwi基因對黑腹果蠅淋巴腺血細胞分化的影響，我們利用P1及L1抗體分別檢測漿細胞及薄層細胞的分化情況。結果顯示，與對照e33C-Gal4/+(淋巴腺中P1陽性細胞比例32.21%±3.241%)相比，e33C>piwiRNAi淋巴腺中P1陽性細胞比例(51.26%±2.638%)顯著增加(P<0.001)(圖4: A-C)，即漿細胞過度分化；此外約有20%的e33C>piwiRNAi淋巴腺中出現(xiàn)薄層細胞，而對照中未發(fā)現(xiàn)薄層細胞(圖4: D-G)。

3 討論

果蠅的造血譜系與脊椎動物相比相對簡單，但果蠅血細胞在免疫防御中的功能及調控血細胞發(fā)育的信號通路都與人類血細胞十分相似，一些保守的信號通路如JAK/STAT, JNK, Ras/EGFR及Toll等在果蠅造血中都具有重要的作用，因此果蠅已逐漸成為研究血細胞分化及細胞免疫的良好模型(Bouletetal., 2018)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)果蠅Forkhead轉錄因子家族成員Jumu可通過多種方式調控血細胞增殖及分化，而jumu在游離血細胞中的缺失可導致piwi的轉錄水平降低(Hao and Jin, 2017; Haoetal., 2018)。為研究Piwi蛋白在果蠅造血中的作用，我們首先利用抗體檢測確定了Piwi在游離血細胞及淋巴腺中的表達，且發(fā)現(xiàn)該蛋白水平在jumu突變體血細胞中明顯降低(結果未顯示)，該結果進一步證實Jumu對piwi的調控作用。同時鑒于Jumu在果蠅造血中的功能，我們推測piwi基因也可能參與果蠅造血。

圖3 敲低piwi基因對黑腹果蠅淋巴腺血細胞增殖的影響Fig. 3 Effect of piwi knock-down on the proliferation of lymph gland hemocytes of Drosophila melanogasterA-F: 分別為野生型w1118(A-D)、對照e33C-Gal4/+基因型(E)及e33C>piwi RNAi基因型(F)淋巴腺Piwi信號檢測 Piwi expression in the wild type w1118 (A-D), control e33C-Gal4/+ (E) and e33C>piwi RNAi (F) lymph gland, respectively; C: A與B圖的疊加圖Merge of Figs. A and B; D: C圖紅色虛線區(qū)域的放大圖Magnified view of the red dotted area of Fig. C; G, I: PH3抗體染色PH3 antibody staining; H, J: α-tubulin與PH3疊加圖Merge of α-tubulin and PH3; K: Piwi在淋巴腺中的平均熒光強度Mean fluorescence intensity of Piwi in lymph glands; L: 淋巴腺第1葉片中PH3陽性細胞數(shù)量Number of PH3+ cells in lymph gland lobe 1; M: 淋巴腺第1葉片的面積Area of lymph gland lobe 1. ***P<0.001; ns無顯著差異No significant difference (P>0.05)(t檢驗t-test).

圖4 敲低piwi基因對黑腹果蠅淋巴腺血細胞分化的影響Fig. 4 Effect of piwi knock-down on the differentiation of lymph gland hemocytes of Drosophila melanogasterA-B: P1抗體(漿細胞的標簽蛋白NimC1)染色與DAPI疊加圖Merge of P1 antibody (plasmatocyte marker protein NimC1) staining and DAPI; C: P1陽性細胞比例Proportion of P1 positive cells; D, F: L1抗體(薄層細胞標簽蛋白)染色L1 antibody (lamellocyte marker protein) staining; E, G: L1抗體染色與DAPI 疊加圖Merge of L1 antibody staining and DAPI. ***P<0.001; ns無顯著差異No significant difference (P>0.05) (t檢驗t-test).

目前，關于PIWI/piRNA在果蠅的研究中主要集中在生殖細胞發(fā)生及早期胚胎發(fā)育。與PIWI蛋白結合的piRNAs通過堿基配對與目標mRNA相互作用，PIWI蛋白通過其核酸內切酶活性對靶mRNA進行切割和降解調控， 促進配子的發(fā)育 (Rojas-Ríos and Simonelig, 2018)。此外，研究發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白是早期胚胎發(fā)生過程中正常有絲分裂所必需的，piwi基因缺失可引起星狀體、紡錘體及中心體形成異常，進而導致細胞不能進行正常有絲分裂且出現(xiàn)異常形態(tài)的細胞核(Manietal., 2014)。根據(jù)該研究結果，為進一步分析Piwi是否可通過調控有絲分裂來影響血細胞增殖，我們分別檢測了piwi基因敲低的游離血細胞及淋巴腺血細胞的增殖情況。結果發(fā)現(xiàn)敲低piwi基因導致游離血細胞中處于有絲分裂M期細胞數(shù)量明顯增加(圖2)，加速細胞有絲分裂進程，最終導致游離血細胞過度增殖。盡管Piwi蛋白在整個淋巴腺中都有較高水平的表達，但該基因缺失并未影響淋巴腺血細胞增殖(圖3)。此外，我們發(fā)現(xiàn)piwi基因敲低果蠅游離血細胞及淋巴腺中細胞核形態(tài)及排列均正常，且未出現(xiàn)類似胚胎早期發(fā)育時期的有絲分裂缺陷表型，該結果表明Piwi在不同組織器官中調控細胞有絲分裂方式不同。此外，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)jumu基因的缺失也會導致血細胞的過度增殖及有絲分裂缺陷(Haoetal., 2018)，本研究結果可進一步證明piwi基因是jumu調控血細胞增殖的影響因子之一。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，piwi在淋巴腺中敲低可導致血細胞的異常分化，包括漿細胞的過度分化及薄層細胞的產生(圖4)。我們前期研究表明與piwi基因相似，jumu缺失可引起薄層細胞的產生，因此piwi基因也可能是jumu調控薄層細胞生成的間接作用因子。此外，已有研究表明Piwi通過BMP信號通路參與生殖細胞的不對稱分裂(Szakmaryetal., 2005)，研究還發(fā)現(xiàn)Piwi通過JAK-STAT信號通路參與急性應激引起的果蠅腸道干細胞增殖(Sousa-Victoretal., 2017)，而BMP與JAK-STAT信號通路均參與果蠅造血作用(Krzemieńetal., 2007; Pennetieretal., 2012)，由此推測Piwi對淋巴腺血細胞分化的調控也可能與這兩個信號通路有關。

綜上所述，本研究利用Gal4/UAS系統(tǒng)及RNAi技術組織特異性降低piwi基因的表達來研究該基因在果蠅造血中作用，發(fā)現(xiàn)piwi可調控游離血細胞增殖及淋巴腺血細胞的分化。下一步，我們將進一步分析piwi在果蠅造血作用中參與的信號通路并驗證與jumu基因、BMP及JAK-STAT信號通路的調控關系，為深入研究果蠅血細胞增殖與分化的調控機制提供基礎。