潘厚軍，康佳磊，張德鋒，常藕琴，任 燕，王亞軍，蔣俊賢，王 琳，石存斌

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380）

長(zhǎng)期以來(lái)寄生蟲(chóng)疾病給魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且難以得到有效控制。寄生蟲(chóng)侵襲魚(yú)體，不但引起魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，抵抗力下降，苗種大量寄生時(shí)還可直接引起大量死亡，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。其中纖毛類(lèi)寄生蟲(chóng)對(duì)魚(yú)類(lèi)苗種危害尤為嚴(yán)重，例如多子小瓜蟲(chóng) (Ichthyophthirius multifiliis) 感染，死亡率可高達(dá)90%，甚至造成“全軍覆滅”。由于寄生蟲(chóng)具有依賴(lài)于宿主才能完成其生活史的特性，其離體培養(yǎng)非常困難，這是寄生蟲(chóng)藥物篩選的技術(shù)瓶頸[1]。

嗜熱四膜蟲(chóng) (Tetrahymena thermophila) 是一種單細(xì)胞真核生物，在分類(lèi)地位上隸屬于原生動(dòng)物門(mén)、纖毛綱，因其可在實(shí)驗(yàn)室條件下純培養(yǎng)、具有成熟的分子操作技術(shù)和清晰的遺傳背景而成為一種被廣泛研究的模式生物[2-4]。采用嗜熱四膜蟲(chóng)，不僅在細(xì)胞和分子生物學(xué)方面獲得重要成果，在藥物研發(fā)方面也取得了重要進(jìn)展，已有部分學(xué)者分析了多種藥物對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)生長(zhǎng)繁殖、氧化應(yīng)激、基因表達(dá)等方面的影響[5-10]，為嗜熱四膜蟲(chóng)作為模式生物、篩選抗蟲(chóng)藥物奠定了前期研究基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，在魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中，中草藥及其有效成分如青蒿 (Artemisia annua)[11]、大黃 (Rheum palmatum)[12]、黃連 (Coptis chinensis)[13]等的使用不僅可以預(yù)防寄生蟲(chóng)病害[14-15]，還可以提升魚(yú)體的免疫力[16]和抗氧化性能[17]，是控制魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)病藥物篩選的寶庫(kù)。中草藥單體是從中草藥的根、莖、葉等部位中提取并高度純化的物質(zhì)，其化學(xué)成分明確，作用機(jī)理可循[18-19]，是良好的替抗藥物的候選。本研究以康奈爾大學(xué)惠贈(zèng)的嗜熱四膜蟲(chóng)Cu428.2株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿 (又名黃連素) 4種中草藥單體對(duì)Cu428.2蟲(chóng)株增殖、氧化應(yīng)激指標(biāo)活性以及細(xì)胞凋亡的影響，以期建立利用嗜熱四膜蟲(chóng)篩選抗魚(yú)纖毛類(lèi)寄生蟲(chóng)中草藥的方法。

1 材料與方法

1.1 嗜熱四膜蟲(chóng)蟲(chóng)株、培養(yǎng)基及試劑

嗜熱四膜蟲(chóng)Cu428.2株由美國(guó)康奈爾大學(xué)惠贈(zèng)；Neff培養(yǎng)基配方為多價(jià)蛋白胨2.5 g，酵母提取物 2.5 g，D-無(wú)水葡萄糖 5.0 g，9.0 g·L-1三氯化鐵 (FeCl3) 儲(chǔ)存液1.0 mL，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌30 min，常溫保存；總超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶 (Catalase,CAT)、丙二醛 (Malonyldialdehyde, MDA) 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，Hoechst 33258染色試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司出品。

1.2 儀器與設(shè)備

Elipse Ti數(shù)碼倒置熒光顯微鏡 (日本Nikon公司)；IC 1000 (Countstar) 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海瑞鈺生物科技公司)；ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)；3K-15高速冷凍離心機(jī) (德國(guó)Sigma公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 中草藥單體

4種中草藥單體詳見(jiàn)表1。分別稱(chēng)取中草藥單體100 mg，加入10 mL助溶劑二甲基亞砜(DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別，Sigma-Aldrich公司)，即刻加入無(wú)菌水 90 mL，配成含 1.0 mg·mL-1(1.0 g·L-1) 藥液的母液，DMSO體積分?jǐn)?shù)為10% (0.1 mL·mL-1)，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)加適量培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

表1 實(shí)驗(yàn)的4種中草藥單體Table 1 Four kinds of Chinese herbal monomers used in experiment

1.4 嗜熱四膜蟲(chóng)的活化培養(yǎng)

取室溫保存的嗜熱四膜蟲(chóng)，以5%接種于10 mL Neff培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再按照培養(yǎng)基總體積的2% (1.0 mL)接種于 49 mL Neff培養(yǎng)基中，28 ℃ 100 r·min-1培養(yǎng)24 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期。

1.5 Hoechst 33 258檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱四膜蟲(chóng)按終密度5.5×104個(gè)·mL-1接種于50 mL反應(yīng)體系的Neff培養(yǎng)液中。設(shè)置對(duì)照組 (DMSO 20 mg·L-1) 和中草藥單體實(shí)驗(yàn)組 (質(zhì)量濃度分別為 2.0、20、200 mg·L-1)，于 28 ℃、100 r·min-1搖床培養(yǎng) 48 h 后，10 000 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，棄上清。加沉淀2～3倍體積的Hoechst 33258染色液，室溫避光培養(yǎng)20 min，2 000 r·min-1離心5 min棄染液。用磷酸鹽緩沖溶液 (PBS, pH 7.4) 洗2次，取20 μL細(xì)胞懸液滴在載玻片上，加入抗熒光淬滅封片液，并蓋上潔凈的蓋玻片。熒光顯微鏡紫外光下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞活力測(cè)定

1.6.1 藥物暴露 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱四膜蟲(chóng)按終密度 5.5×104個(gè)·mL-1接種于50 mL 反應(yīng)體系的Neff培養(yǎng)液中，加入死亡率介于0～100% (需經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn))、按常用對(duì)數(shù)間距0.2設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度(5.0、8.0、12.5、20、32、50 mg·L-1) 的受試藥物及10% DMSO溶劑組，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行，并設(shè)置空白對(duì)照 (僅培養(yǎng)基) 及不加藥物對(duì)照(有培養(yǎng)基、嗜熱四膜蟲(chóng)，不加藥物)，于28 ℃、100 r·min-1的搖床中培養(yǎng)暴露處理24 h，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8法細(xì)胞活力測(cè)定。

1.6.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 取待測(cè)的嗜熱四膜蟲(chóng)試液，用75%乙醇以1∶1固定，取20 μL加入Countstar計(jì)數(shù)板，使用Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值 (±SD)。以中草藥單體質(zhì)量濃度 (mg·L-1) 為橫坐標(biāo)，嗜熱四膜蟲(chóng)密度(104個(gè)·mL-1) 為縱坐標(biāo)，繪制嗜熱四膜蟲(chóng)密度在不同濃度單體作用下的折線(xiàn)圖。同時(shí)采用SPSS 20.0軟件計(jì)算藥物對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)生長(zhǎng)的半抑制濃度(IC50)和95%置信區(qū)間 (95% CI)。

1.6.3 CCK-8細(xì)胞活力 取藥物處理后的嗜熱四膜蟲(chóng)試液，加入96孔板，每孔加入10 μL的CCK-8試劑混勻，28 ℃培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度 (A)。CCK-8活力計(jì)算公式為：細(xì)胞活力 (T/C, %)=[(A實(shí)驗(yàn)-A空白)]/[(A對(duì)照-A空白)]×100%。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值(±SD)。

參考1.6.2 的方法，以中草藥單體質(zhì)量濃度(mg·L-1) 為橫坐標(biāo)，CCK-8 細(xì)胞活力 (T/C, %) 為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞活力在單體作用下的折線(xiàn)圖，同時(shí)采用SPSS 20.0軟件計(jì)算藥物對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)生長(zhǎng)的IC50和 95% CI。

1.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)試

根據(jù)1.6中 IC50的結(jié)果，設(shè)置50 mL (Neff培養(yǎng)基+中草藥單體) 試液體系，質(zhì)量濃度按等對(duì)數(shù)間距，4個(gè)藥物均設(shè)置1.25、3.2、5.0、8.0、12.5、20.0、32.0、50 mg·L-1的試液，每個(gè)濃度分別設(shè)置3個(gè)平行，另設(shè)置DMSO對(duì)照組。移取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱四膜蟲(chóng)，按5%的比例至各實(shí)驗(yàn)體系中，28 ℃、100 r·min-1搖床培養(yǎng)，即置于有藥物的試液中處理4 h，10 000 r·min-1離心10 min，去上清，留沉淀提取嗜熱四膜蟲(chóng)細(xì)胞，使用PBS洗2遍，在冰上勻漿。4 ℃、3 500 r·min-1離心10 min，將上清液吸出，分裝入凍存管 -80 ℃保存?zhèn)溆?。使用南京建成生物公司出品的SOD、CAT、MDA檢測(cè)試劑盒，測(cè)定不同濃度中草藥單體作用下的酶活力，具體測(cè)試方法參照試劑盒說(shuō)明。

以藥物質(zhì)量濃度 (mg·L-1) 為橫坐標(biāo)，酶活力(U·mg-1) 為縱坐標(biāo)，繪制嗜熱四膜蟲(chóng)的3種酶活力在中草藥單體作用下的柱形圖。采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析，組間比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析4種中草藥單體對(duì)SOD、CAT、MDA的影響。

2 結(jié)果

2.1 中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)凋亡的影響

不同濃度的4種中草藥單體 (青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿) 對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)處理24 h后，經(jīng)過(guò)Hoechst 33258 染色，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著藥物濃度的增加，產(chǎn)生強(qiáng)熒光的著色細(xì)胞增多，4種中草藥單體藥物高濃度處理組 (20～200 mg·L-1) 比對(duì)照組的細(xì)胞著色明顯增加，大量嗜熱四膜蟲(chóng)的細(xì)胞核呈濃染致密、明亮鮮艷的顆粒狀熒光。2.0 mg·L-1處理組，除青蒿素外，3種藥物的凋亡細(xì)胞亦比對(duì)照組顯著增加，其中青蒿素2.0 mg·L-1處理組凋亡細(xì)胞比對(duì)照組少。

圖1 4種中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)Cu428.2凋亡的影響 (Hoechst 33258試劑染色)A. 青蒿素；B. 大黃素；C. 蘆薈大黃素；D. 小檗堿；1、2、3、4示藥物質(zhì)量濃度分別為0、2.0、20、200 mg·L-1。Figure 1 Effect of four kinds of Chinese herbal monomers on apoptotic morphology of T. thermophila Cu428.2 (stained by Hoechst 33258)A. Artemisinin; B. Emodin; C. Aloe-emodin; D. Berberine; 1, 2, 3 and 4 show the monomer concentration as 0, 2.0, 20, 200 mg·L-1; respectively.

2.2 中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)種群增長(zhǎng)和細(xì)胞活力的影響

將4種中草藥單體稀釋成不同濃度，分別處理嗜熱四膜蟲(chóng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)得的嗜熱四膜蟲(chóng)活細(xì)胞密度和CCK-8法測(cè)得的細(xì)胞活力結(jié)果見(jiàn)圖2，2種方法計(jì)算的IC50結(jié)果見(jiàn)表2。CCK-8法與活細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果較為一致，隨著3種中草藥單體 (大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿) 濃度的增加，采用計(jì)數(shù)法測(cè)量的活細(xì)胞密度、CCK-8法測(cè)量的細(xì)胞活力均降低；而青蒿素在低質(zhì)量濃度 (5.0 mg·L-1) 增加，質(zhì)量濃度≥8.0 mg·L-1降低。

表2 活細(xì)胞計(jì)數(shù)法、CCK-8法測(cè)得的4種中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)的半抑制濃度Table 2 50% inhibitory concentration (IC50) of four kinds of Chinese herbal monomers to T. thermophila Cu428.2 determined by living cell counting method and CCK-8 test

圖2 不同濃度的4種單體作用下嗜熱四膜蟲(chóng)Cu428.2株的活細(xì)胞密度和CCK-8細(xì)胞活力a. 活細(xì)胞密度；b. CCK-8細(xì)胞活力。Figure 2 Cell Density and CCK-8 Cell viability of T. thermophila Cu428.2 at different concentrations of four kinds of Chinese herbal monomersa. Living cell density; b. CCK-8 cell viability.

IC50結(jié)果為：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，抑制作用由強(qiáng)到弱依次為蘆薈大黃素＞大黃素＞青蒿素＞小檗堿；采用CCK-8法，亦為蘆薈大黃素＞大黃素＞青蒿素＞小檗堿；而數(shù)值大小略有不同。結(jié)果表明，2種方法測(cè)得的數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致而數(shù)值有一定差別。結(jié)合2種方法評(píng)估中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)的作用較好。

2.3 中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)酶活力的影響

嗜熱四膜蟲(chóng)經(jīng)中草藥單體處理4 h后，SOD、CAT、MDA酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，在1.25～50 mg·L-1的藥物濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，SOD活性先升高后降低；而CAT有升高趨勢(shì)，MDA有降低趨勢(shì)。表明該4種中草藥單體對(duì)此3種酶活力指標(biāo)的影響具有一致性，而具體在某一濃度下對(duì)某種酶的活力影響有所不同。

圖3 嗜熱四膜蟲(chóng)Cu428.2在4種中草藥單體分別處理后超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、丙二醛活力*. 與對(duì)照組差異顯著 (P＜0.05)；**. 與對(duì)照組差異極顯著 (P＜0.01)。Figure 3 SOD, CAT and MDA activity of T. thermophila Cu428.2 after treatment of four kinds of Chinese herbal monomers*. The difference is significant with the control group (P＜0.05); **. The difference is extraordinary significant with the control group (P＜0.01).

3 討論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖中大量化學(xué)藥物的使用，水體環(huán)境污染愈發(fā)嚴(yán)重，也增強(qiáng)了寄生蟲(chóng)的抗藥性。開(kāi)發(fā)綠色環(huán)保、無(wú)污染、無(wú)抗性的中草藥防治魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中的病害刻不容緩。中草藥單體成分明確、效應(yīng)明顯，是今后中草藥應(yīng)用的方向之一。青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素和小檗堿均是中草藥單體物質(zhì)，前人的研究顯示其有抗蟲(chóng)效應(yīng)，如青蒿素對(duì)瘧原蟲(chóng)[20-21]、血吸蟲(chóng)[21]和球蟲(chóng)[21]有效，大黃素對(duì)瘧原蟲(chóng)[22]、蘆薈大黃素對(duì)利什曼原蟲(chóng)[23]和瘧原蟲(chóng)[24]有效，小檗堿除對(duì)利什曼原蟲(chóng)[25]有效外還對(duì)多種原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)有效[15]。本研究同時(shí)分析4種單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)的效應(yīng)，結(jié)果表明，青蒿素、蘆薈大黃素、小檗堿、大黃素等4種中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)增殖的影響有劑量效應(yīng)關(guān)系，在一定濃度下可致嗜熱四膜蟲(chóng)凋亡，具有抑制生長(zhǎng)的作用，與鉤吻堿(Koumine，斷腸草里提取的一種生物堿)[9]對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)的效應(yīng)有類(lèi)似之處。有意思的是，青蒿素在低濃度時(shí)有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，可能在低濃度時(shí)其作為培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分起了主要作用，這與柴小翠等[26]報(bào)道的低濃度竹節(jié)參 (Panax japonicus) 能促進(jìn)生長(zhǎng)的分析相似。

本研究主要采用Hoechst染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和CCK-8法3種不同的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以探究4種中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)的抑制生長(zhǎng)效應(yīng)。Hoechst染料具特異性強(qiáng)、熒光性能強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)方式快捷的優(yōu)點(diǎn)，試劑穿過(guò)細(xì)胞膜與DNA相結(jié)合進(jìn)行染色，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)固縮，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈濃染致密的顆粒狀熒光，或呈碎塊狀致密濃染，發(fā)出強(qiáng)烈藍(lán)色熒光，與背景形成鮮明對(duì)比。凋亡細(xì)胞與活細(xì)胞對(duì)比明顯，從而可以直觀地分析藥物在一定濃度范圍是否有凋亡作用。嗜熱四膜蟲(chóng)的計(jì)數(shù)方法以往是固定后采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，人為誤差較大且較煩瑣，本研究采用Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，成像后采用電腦直觀計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，可減少人為誤差，且快捷方便。CCK-8法是一種WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，被線(xiàn)粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物 (Formazan dye)，生成的甲瓚物顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)量成正比，因而可以采用酶標(biāo)儀定量分析，是一種靈敏度較高、重復(fù)性好的細(xì)胞活性檢測(cè)方法，適合在分析藥物對(duì)細(xì)胞增殖影響、細(xì)胞活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用[27]。CCK-8法步驟較為簡(jiǎn)單，相對(duì)于細(xì)胞計(jì)數(shù)法更客觀、穩(wěn)定性更強(qiáng)，是一種較為理想的測(cè)試藥物對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)影響的研究方法。本研究采用3種不同的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)4種中草藥單體處理后嗜熱四膜蟲(chóng)的影響進(jìn)行評(píng)估，在Hoechst熒光染色形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8實(shí)驗(yàn)，獲得中草藥單體的IC50數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確可行。本研究表明，在中草藥單體作用下，嗜熱四膜蟲(chóng)隨著藥物濃度的變化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和CCK-8實(shí)驗(yàn)分別獲得的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)；獲得的IC50具有一致性，但數(shù)據(jù)有所區(qū)別。筆者認(rèn)為，CCK-8法更為客觀，必要時(shí)結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析則更為可靠。

為探究嗜熱四膜蟲(chóng)凋亡的機(jī)理，本研究分析了中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)氧化應(yīng)激的影響。已有研究表明，這4種中草藥單體對(duì)動(dòng)物抗氧化作用有顯著影響[28-31]。SOD、CAT和MDA是生物體和細(xì)胞內(nèi)3種重要的氧化應(yīng)激指標(biāo)，其中SOD和CAT是生物體內(nèi)極其重要的抗氧化酶，能清除超氧陰離子自由基 ()，具有非常大的破壞作用，能夠引起細(xì)胞死亡和器官衰老，SOD被認(rèn)為是防衛(wèi)傷害的第一步，它可以將轉(zhuǎn)化為毒性較低的H2O2[32]；而CAT可進(jìn)一步將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[33]。MDA是生物體或細(xì)胞內(nèi)一種脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，反映脂質(zhì)氧化的水平[34]。本研究的4種中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)SOD活性的影響，相較于對(duì)照組，基本為先升高后降低的趨勢(shì)，與潘厚軍等[7]報(bào)道的苯甲酸鈉、廖苑辰等[35]研究的氧化石墨烯對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)SOD的影響均為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的結(jié)果相似，具有劑量效應(yīng)關(guān)系，原因亦為低濃度刺激了嗜熱四膜蟲(chóng)致SOD活力增強(qiáng)，而高濃度使細(xì)胞產(chǎn)生毒害致自由基清除能力下降；本研究與在鉤吻堿[9]和百草枯[36]作用下嗜熱四膜蟲(chóng)SOD活性均升高的結(jié)果有所差異，可能是因?yàn)槭葻崴哪はx(chóng)對(duì)不同藥物在不同濃度下的氧化應(yīng)激適應(yīng)性有所差異所致。本實(shí)驗(yàn)中草藥作用后，CAT含量有升高趨勢(shì)，與有機(jī)紫外防曬劑[37]、抗菌劑三氯生[38]對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)CAT的影響一致，而與抗菌劑三氯卡班[38]不同。單體作用于嗜熱四膜蟲(chóng)后，嗜熱四膜蟲(chóng)的MDA水平降低，其中蘆薈大黃素的效果尤為明顯，表明蘆薈大黃素能顯著降低嗜熱四膜蟲(chóng)的脂質(zhì)水平，這與張瑩瑩等[39]報(bào)道的蘆薈大黃素降低小鼠非酒精性脂肪肝模型的血清MDA水平結(jié)果一致。

本研究表明，中草藥單體可引起纖毛類(lèi)寄生蟲(chóng)的替代模式生物——嗜熱四膜蟲(chóng)凋亡，對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)增殖和凋亡的影響具有劑量效應(yīng)關(guān)系。為解決寄生蟲(chóng)離體培養(yǎng)困難而致抗蟲(chóng)中草藥篩選的瓶頸問(wèn)題，本研究探討了體外應(yīng)用嗜熱嗜熱四膜蟲(chóng)的途徑。中草藥在魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)的防控實(shí)踐中是否有效，仍有待進(jìn)行魚(yú)體臨床試驗(yàn)。本研究結(jié)果為抗魚(yú)寄生蟲(chóng)中草藥大通量篩選的體外技術(shù)提供了可能途徑。

4 結(jié)論

采用Hoechst 33258染色在熒光顯微鏡下觀察，濃度為20～200 mg·L-1的青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿等4種中草藥單體可引起嗜熱四膜蟲(chóng)凋亡；中草藥單體對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)Cu428.2株的增殖具有抑制效應(yīng)，采用CCK-8法與活細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)得的IC50較為一致；在單體濃度為1.25～50.0 mg·L-1，隨著藥物濃度的升高，CAT有升高趨勢(shì)，而MDA活性有降低趨勢(shì)，SOD先升高后降低。研究結(jié)果可為應(yīng)用嗜熱四膜蟲(chóng)篩選抗寄生蟲(chóng)中草藥平臺(tái)技術(shù)的建立提供方法。